VetLine Ehrlichia, Elisa kit

Descripción

INTRODUCCIÓN

La erliquiosis monocítica canina (EMC) es una enfermedad canina infecciosa que se produce en todo el mundo en las regiones tropicales y subtropicales, así como en la zona mediterránea de Europa. Es causada por la perrera Ehrlichia, un gram-negativo, que obliga a una bacteria intracelular del orden Rickettsiales. Ehrlichia kennels se transmite por la garrapata marrón del perro Rhipicephalus sanguineus. El período de incubación es de aproximadamente 1-3 semanas.

La erliquiosis monocítica canina se divide en 3 fases:

Fase aguda:
La fase aguda dura unas 2-4 semanas. En esta fase hay un fuerte aumento de la Ehrlichia dentro de los monocitos y linfocitos de la sangre. Los síntomas suelen ser inespecíficos: puede haber fiebre, pérdida de apetito, dificultad para respirar, anemia, trombocitopenia e hinchazón de los ganglios linfáticos.

Fase subclínica:
En esta etapa, la enfermedad suele ser asintomática, aunque se pueden detectar cambios en los valores sanguíneos. El sistema inmunológico produce cada vez más anticuerpos que destruyen las células sanguíneas afectadas. La fase subclínica puede durar desde semanas hasta varios años.

Fase crónica:
Si no se pueden eliminar todos los patógenos, el resultado será una enfermedad crónica. Suele ocurrir en perros inmunosupresores. Los animales tienen síntomas como depresión de la médula ósea, hemorragias, enfermedades neurológicas, edema periférico y demacración.

La erliquiosis monocítica canina suele ir acompañada de coinfecciones como la babesiosis y la anaplasmosis.

Métodos de detección:

• Detección directa de patógenos: frotis de sangre teñido de Giemsa con evidencia de una acumulación característica de bacterias en los monocitos (fase de morula). Esta detección sólo es posible en la fase aguda de la infección.
• Detección indirecta de patógenos: detección de anticuerpos mediante IFT o ELISA.

USO PREVISTO

El enzimoinmunoensayo de NovaTec VetLine Ehrlichia ELISA se utiliza para la determinación cualitativa de anticuerpos contra Ehrlichia en suero de veterinario.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

La determinación inmunoenzimático cualitativa de anticuerpos específicos se basa en la técnica ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).

Las Placas de Microtitulación están recubiertas con antígenos específicos unen a los anticuerpos de la muestra. Después de lavar los pocillos para eliminar todo el material de muestra no unido, el conjugado de peroxidasa de rábano (HRP) se añade. Este conjugado se une a los anticuerpos capturados. En una segunda etapa de lavado se retira el conjugado no unido. El complejo inmune formado por el conjugado unido se visualizó añadiendo substrato tetrametilbencidina (TMB), que da un producto de reacción azul.

La intensidad de este producto es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos en la muestra. se añade ácido sulfúrico para detener la reacción. Esto produce un cambio de color de azul a amarillo. La extinción a 450/620 nm se mide con un fotómetro de Placa de Microtitulación ELISA.

REACTIVOS SUMINISTRADOS

• Placa de Microtitulación: 12 tiras de 8 pocillos rompibles, recubiertos con antígenos de Ehrlichia, en bolsa de aluminio.
• Tampón de Dilución de Muestras: 1 botella de 100 mL de solución de tampón de fosfato (10 mM) para diluir la muestra; pH 7,2 ± 0,2; color amarillo; listo para ser utilizado; tapa blanca; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/MIT (3:1).
• Solución de Parada: 1 botella de 15 mL de ácido sulfúrico, 0,2 mol/L, listo para ser utilizado; tapa roja.
• Tampón de Lavado (20x conc.): 1 botella de 50 mL de una solución de tampón de fosfato 20x concentrado (0,2 M) para lavar los pocillos; pH 7,2 ± 0,2; tapa blanca.
• Conjugado: 1 botella de 20 mL Proteina A/G conjugada con peroxidasa de rábano (HRP); color amarillo; tapa blanca; listo para ser utilizado; ≤ 0.02 % (v/v) MIT.
• Solución de Sustrato de TMB: 1 botella de 15 mL 3,3´,5,5´-tetrametilbenzindina (TMB), < 0,1 %; listo para ser utilizado; tapa amarilla.
• Control Positivo: 1 botella de 2 mL control; color amarillo; tapa roja; listo para ser utilizado; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
• Control Cut-off: 1 botella de 3 mL control; color amarillo; tapa verde; listo para ser utilizado; ≤ 0.02% (v/v) MIT.
• Control Negativo: 1 botella de 2 mL control; color amarillo; tapa azul; listo para ser utilizado; ≤ 0.0015% (v/v) CMIT/MIT (3:1).

Para indicaciones de peligro y consejos de prudencia consulte el cap. 12.1. Para sustancias potencialmente peligrosas por favor revise la ficha de datos de seguridad.

ACCESORIOS SUMINISTRADOS

• 1 lámina autoadhesiva.
• 1 instrucciones de uso.
• 1 esquema de la placa.

MATERIALES E INSTRUMENTOS NECESARIOS

• Fotómetro de Placa de Microtitulación con filtros de 450/620 nm.
• Incubadora 37 °C.
• Dispositivo de lavado manual o automático para Placa de Microtitulación.
• Micropipetas para uso de (10-1000 µL).
• Mezcladora Vortex.
• Agua destilada.
• Tubos de plástico desechables.

ESTABILIDAD Y ALMACENAJE

Almacene el kit a 2 – 8 °C. Los reactivos abiertos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se almacena a 2 – 8 °C.

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Es muy importante llevar todos los reactivos y las muestras para a la temperatura ambiente (20 – 25 °C) y mezclarlos antes de ser utilizados!

Placa de Microtitulación
Las tiras rompibles están recubiertas con antígenos del Ehrlichia; Inmediatamente después de la eliminación de las tiras, las tiras restantes deben sellarse de nuevo en el papel de aluminio junto con la bolsita di dióxio de silicio y almacenar a 2 – 8 °C.

Tampón de Lavado (20x conc.)
Diluir la Tampón de Lavado 1+19; por ejemplo 10 mL de la Tampón de Lavado + 190 mL de agua destilada. La Tampón de Lavado diluido es estable durante 5 días a temperatura ambiente o a 2 – 8 °C. Caso aparecen cristales en el concentrado, calentar la solución a 37 °C, por ejemplo, en un baño María. Mezclar bien antes de la dilución.

Solución de Sustrato de TMB
La solución está listo para su uso y debe almacenarse a 2 – 8 °C, protegida de la luz. La solución debe ser incolora o podría tener un color ligeramente azul claro. Si el sustrato se convierte en azul, es posible que haya sido contaminado y no puede ser utilizada en el ensayo.

TOMA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Usar muestras de suero canino con este ensayo. Si el ensayo se realiza dentro de 5 días después de la toma de sangre, las muestras pueden ser almacenadas de 2…8 °C, en caso contrario deben ser alicotadas y almacenadas congeladas (-70…-20 °C). Agitar bien las muestras descongeladas antes de diluirlas. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. No se recomienda la inactivación por calor de las muestras.

Dilución de las muestras
Antes del ensayo, las muestras tienen que estar diluidas en relación 1 + 100 con el Tampón de Dilución de Muestras, por ejemplo 10 µL de la muestra con 1 mL de Tampón de Dilución de Muestras, mezclar bien con la mezcladora Vortex.

PROCEDIMIENTO

Por favor, leer cuidadosamente las instrucciones de uso del ensayo antes de realizarlo. Para el buen funcionamiento de la técnica es necesario seguir las instrucciones. El siguiente procedimiento es válido solamente para el método manual. Si se realiza el ensayo en los sistemas automáticos de ELISA es aconsejable elevar el número de lavado de tres hasta cinco veces y el volumen de Tampón de Lavado de 300 µL a 350 µL para excluir efectos de lavado. Preste atención al capítulo 12. Antes de comenzar, especificar exactamente la repartición y posición de las muestras y de los estándares/controles (recomienda determinar en doble) en lo esquema de la placa suministrada. Usar la cantidad necesaria de tiras o pozos e insertarlos en el soporte.

Realizar el ensayo en el orden indicado y sin retraso.

Para cada paso de pipeteado en los estándares/controles y en las muestras, usar siempre puntas de pipeta de un solo uso.

Graduar la incubadora a 37 ± 1°C.

1. Pipetear 100 µL de estándares/controles y muestras en los pocillos respectivos. Dejar el pocillo A1 para el blanco.
2. Recubrir las tiras con los autoadhesivos suministrados.
3. Incubar 1 h ± 5 min a 37 ± 1°C.
4. Después de la incubación, retirar el autoadhesivo, aspirar el líquido de la tira y lavarla tres veces con 300 µL de la Tampón de Lavado. Evitar el rebosamiento de los pocillos. El intervalo entre lavado y aspiración debe ser > 5 segundos. Para sacar el líquido restante de las tiras, es conveniente sacudirlas sobre papel absorbente.
   Nota: El lavado es muy importante! Un mal lavado insuficiente provoca una baja precisión y resultados falsamente elevados!.
5. Pipetar 100 µL de Conjugado en cada pocillo con excepción del blanco substrato A1.
6. Incubar 30 min a la temperatura ambiente (20-25 °C). Evitar la luz solar directa.
7. Repetir el lavado como en el paso numero 4.
8. Pipetar 100 µL de la Solución de Sustrato de TMB en todos los pocillos.
9. Incubar exactamente 15 min en oscuridad a temperatura ambiente (20…25 °C). Un color azul se produce en las muestras positivas debido a la reacción enzimática.
10. Pipetear en todos los pocillos 100 µL de la Solución de Parada en el mismo orden y mismo intervalo de tiempo como con la Solución de Sustrato de TMB, por lo tanto un cambio de color de azul a amarillo se produce.
11. Medir la extinción con 450/620 nm en un periodo de 30 min después de añadir la Solución de Parada.

Medición
Ajustar el fotómetro de Placa de Microtitulación ELISA al cero utilizando el Blanco

Si por razones técnicas el fotómetro de Placa de Microtitulación de ELISA no se pueder ajustar a cero utilizando el Blanco, el valor de la absorbancia desto debe ser sustraído de los demás valores de absorbancia medidos con el fin de obtener resultados fiables!

Medir la extinción de todos los pocillos con 450 nm y anotar los resultados de los estándares/controles y de las muestras en la esquema de la placa.

Es aconsejable realizar la medición bicromática a una longitud de onda de referencia de 620 nm.

Si se efectuaron análisis en duplicado o múltiples, hay que calcular el promedio de los valores de extinción de los pocillos correspondientes.

CALCULO DE LOS RESULTADOS

Criterios de validez del ensayo
El ensayo es válido si se cumplen los siguientes criterios:

• Blanco: valor de la extinción < 0,100.
• Control negativo: valor de la extinción < 0,200 y < Cut-off.
• Control cut-off: valor de la extinción 0,150 – 1,300.
• Control positivo: valor de la extinción > Cut-off.

Si estos criterios no se cumplen, la prueba no es váida y deberá repetirse.

Calculo del valor de la medición
El Cut-off se obtiene de los valores de la extinción de lo Control cut-off.

Ejemplo: 0,42 OD Control cut-off + 0,44 OD Control cut-off = 0,86:2 = 0,43
Cut-off = 0,43

Resultados en unidades [NTU]
Promedio valor de la extinción de la muestra x 10 / Cut-off = [NovaTec-unidades = NTU] 

Ejemplo: 1,591 x 10 / 0,43 = 37 NTU

Interpretación de los resultados
Los intervalos de valores normales para el ELISA deben ser establecidos por cada laboratorio con base en las muestras de la propia población en las áreas geográficas atendidas. Estos son los datos normativos: