VetLine Babesia canis, Elisa Kit

Descripción

PRINCIPIO DEL ENSAYO

La determinación inmunoenzimática cualitativa de anticuerpos específicos se basa en la técnica ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).

Las placas de microtitulación están recubiertas con antígenos específicos para unirse a los anticuerpos correspondientes de la muestra. Después de lavar los pocillos para eliminar todo el material de muestra no unido, se añade un conjugado marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Este conjugado se une a los anticuerpos capturados.

En un segundo paso de lavado se elimina el conjugado no unido. El complejo inmunológico formado por el conjugado unido se visualiza añadiendo un sustrato de tetrametilbencidina (TMB), que da un producto de reacción azul. La intensidad de este producto es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos en la muestra.

Se añade ácido sulfúrico para detener la reacción. Esto produce un color de punto final amarillo. Se lee la absorbancia a 450/620 nm utilizando un lector de microplacas ELISA.

REACTIVOS SUMINISTRADOS

• Placa de microtitulación: 12 tiras separables de 8 pocillos recubiertas con antígenos de Babesia; en papel de aluminio resellable.
• Tampón de dilución de muestras: 1 frasco que contiene 100 ml de tampón fosfato (10 mM) para dilución de muestras; pH 7,2 ± 0,2; de color amarillo; listo para usar; tapón blanco; ≤ 0,0015 % (v/v) CMIT/MIT (3:1).
• Solución de parada: 1 frasco que contiene 15 ml de ácido sulfúrico, 0,2 mol/L; listo para usar; tapón rojo.
• Tampón de lavado (conc. 20x): 1 botella que contiene 50 ml de un tampón de fosfato concentrado 20 veces (0,2 M), pH 0,2 ± 0,2, para lavar los pocillos; tapón blanco.
• Conjugado: 1 frasco que contiene 20 ml de proteína A/G marcada con peroxidasa; de color amarillo, listo para usar; tapón blanco; ≤ 0,02 % (v/v) MIT.
• Solución de sustrato TMB: 1 frasco que contiene 15 ml de 3,3´,5,5´-tetrametilbencidina (TMB), < 0,1 %; listo para usar; tapón amarillo.
• Control positivo: 1 vial que contiene 2 ml de control; de color amarillo; listo para usar; tapón rojo ≤ 0,02 % (v/v) MIT.
• Control de corte: 1 vial que contiene 3 ml de control; de color amarillo; listo para usar; gorra verde; ≤ 0,02 % (v/v) MIT.
• Control negativo: 1 vial que contiene 2 ml de control; de color amarillo; listo para usar; gorra azul; ≤ 0,0015 % (v/v) CMIT/MIT (3:1).

MATERIALES SUMINISTRADOS

• 1 lámina protectora.
• 1 Instrucciones de uso (IFU).
• 1 placa.

MATERIALES Y EQUIPOS NECESARIOS

• Lector de microplacas ELISA, equipado para la medición de absorbancia a 450/620 nm.
• Incubadora 37 °C.
• Equipo manual o automático para enjuagar los pocillos de la microplaca de titulación.
• Pipetas para dispensar volúmenes entre 10 y 1000 µl.
• Mezclador de tubo Vortex.
• Agua destilada.
• Tubos desechables.

ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO

Guarde el kit a 2…8 °C. Los reactivos abiertos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se almacenan a 2…8 °C.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

¡Es muy importante llevar todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente (20 – 25 °C) y mezclarlos antes de comenzar la prueba!

Placa de microtitulación
Las tiras desprendibles están recubiertas con antígenos de Babesia. Inmediatamente después de retirar las tiras, las tiras restantes deben volver a sellarse en papel de aluminio junto con el desecante suministrado y almacenarse a 2…8 °C.

Tampón de lavado (20x conc.)
Diluir el tampón de lavado 1 + 19; por ejemplo 10 mL Tampón de Lavado + 190 mL agua destilada. El tampón diluido es estable durante 5 días a temperatura ambiente (20 – 25 °C). En caso de que aparezcan cristales en el concentrado, calentar la solución a 37 °C, p. en un baño de agua. Mezclar bien antes de la dilución.

Solución de sustrato TMB
El reactivo está listo para usar y debe almacenarse a 2…8 °C, protegido de la luz. La solución debe ser incolora o tener un ligero tinte azul. Si el sustrato se vuelve azul, es posible que se haya contaminado y deba desecharse.

TOMA Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS

Utilice muestras de suero veterinario con este ensayo. Si el ensayo se realiza dentro de los 5 días posteriores a la recolección de la muestra, las muestras deben mantenerse a 2…8 °C; en caso contrario, se deben dividir en alícuotas y almacenar en ultracongelación (-70…-20 °C). Si las muestras se almacenan congeladas, mezcle bien las muestras descongeladas antes de realizar la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. No se recomienda la inactivación térmica de las muestras.

Dilución de muestra
Antes del ensayo, todas las muestras deben diluirse 1+100 con tampón de dilución de muestras. Dispense 10 µL de muestra y 1 ml de tampón de dilución de muestra en tubos para obtener una dilución 1+100 y mezcle bien con un Vortex.

PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

Lea atentamente las instrucciones de uso antes de realizar el ensayo. La confiabilidad de los resultados depende del estricto cumplimiento de las instrucciones de uso descritas. El siguiente procedimiento de prueba sólo está validado para el procedimiento manual. Si realiza la prueba en sistemas automáticos ELISA, recomendamos aumentar los pasos de lavado de tres a cinco y el volumen de tampón de lavado de 300 µL a 350 µL para evitar efectos de lavado. 

Antes de comenzar el ensayo, se debe establecer cuidadosamente el plan de distribución e identificación de todas las muestras y estándares/controles (se recomiendan duplicados) en el diseño de la placa suministrada en el kit. Seleccione el número requerido de tiras o pocillos de microtitulación e insértelos en el soporte. Realice todos los pasos del ensayo en el orden indicado y sin demoras.

Se debe utilizar una punta limpia y desechable para dispensar cada estándar/control y muestra.

Ajustar la incubadora a 37 ± 1 °C.

1. Dispense 100 µl de estándares/controles y muestras diluidas en sus respectivos pocillos. Deje el pocillo A1 para el sustrato en blanco.
2. Cubra los pocillos con el papel de aluminio suministrado en el kit.
3. Incubar durante 1 hora ± 5 min a 37 ± 1 °C.
4. Cuando se haya completado la incubación, retire el papel de aluminio, aspire el contenido de los pocillos y lave cada pocillo tres veces con 300 µl de tampón de lavado. Evite desbordamientos de los pocillos de reacción. El intervalo entre el lavado y la aspiración debe ser > 5 segundos. Al final, retire con cuidado el líquido restante golpeando las tiras sobre papel de seda antes del siguiente paso.
   Nota: ¡El lavado es importante! Un lavado insuficiente da como resultado una precisión deficiente y resultados falsos.
5. Dispense 100 µl de conjugado en todos los pocillos excepto en el pocillo blanco de sustrato A1.
6. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (20…25 °C). No exponga a la luz solar directa.
7. Repita el paso 4.
8. Dispense 100 µl de solución de sustrato TMB en todos los pocillos.
9. Incubar durante exactamente 15 min a temperatura ambiente (20…25 °C) en la oscuridad. Se produce un color azul debido a una reacción enzimática.
10. Dispense 100 µl de solución de parada en todos los pocillos en el mismo orden y al mismo ritmo que para la solución de sustrato TMB, de modo que se produzca un cambio de color de azul a amarillo.
11. Mida la absorbancia a 450/620 nm dentro de los 30 minutos posteriores a la adición de la solución de parada.

Medición
Ajuste el lector de microplacas ELISA a cero utilizando el blanco de sustrato.

Si, por razones técnicas, el lector de microplacas ELISA no se puede ajustar a cero utilizando el blanco de sustrato, reste su valor de absorbancia de todos los demás valores de absorbancia medidos para obtener resultados confiables.

Mida la absorbancia de todos los pocillos a 450 nm y registre los valores de absorbancia para cada estándar/control y muestra en el diseño de la placa.

Se recomienda la medición bicromática utilizando una longitud de onda de referencia de 620 nm.

Cuando corresponda, calcule los valores medios de absorbancia de todos los duplicados.

RESULTADOS

Para que un ensayo se considere válido, se deben cumplir los siguientes criterios:

• Sustrato Blanco: Valor de absorbancia < 0,100.
• Control Negativo: Valor de absorbancia < 0,200 y < Corte.
• Control de corte: Valor de absorbancia 0,150 – 1,300.
• Control positivo: Valor de absorbancia > Punto de corte.

Si no se cumplen estos criterios, la prueba no es válida y debe repetirse.

Cálculo de resultados
El límite es el valor medio de absorbancia de las determinaciones del control de límite.

Ejemplo:
Valor de absorbancia Control de corte 0,44 + Valor de absorbancia Control de corte 0,42 = 0,86 / 2 = 0,43
Corte = 0,43

Resultados en unidades [NTU]
Valor de absorbancia (media) de la muestra x 10 / Cut-off = [Unidades NovaTec = NTU]

Ejemplo: 1,591 x 10 / 0,43 = 37 NTU

Interpretación de resultados

INTERFERENCIAS

No se observan interferencias con muestras hemolíticas, lipémicas o ictéricas hasta una concentración de 10 mg/mL de hemoglobina, 5 mg/mL de triglicéridos y 0,5 mg/mL de bilirrubina.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

La contaminación bacteriana o los ciclos repetidos de congelación y descongelación de la muestra pueden afectar los valores de absorbancia.