VetLine Anaplasma, Elisa kit

Descripción

INTRODUCCIÓN

Las especies de Anaplasma son patógenos bacterianos rickettsiales que residen en los eritrocitos del huésped. Los anaplasmas causan Anaplasmosis y tienen distribución mundial debido a su amplia gama de vectores (garrapatas).

La anaplasmosis o la fiebre transmitida por garrapatas (TBF, por sus siglas en inglés) es una enfermedad rickettsial que afecta los glóbulos blancos de ovinos y bovinos, causando anemia y «fiebre del pasto» estacional. Es causada por Anaplasma phagocytophilum (anteriormente conocido como Ehrlichia phagocytophila). La anaplasmosis estacional ocurre en bovinos que retornan al pasto infectado por garrapatas en la primavera. La anaplasmosis afecta naturalmente principalmente a los ovinos y los bovinos y, menos comúnmente, los ciervos, los caballos y los perros. La anaplasmosis causa enfermedad multisistémica, causando signos cardiovasculares, gastrointestinales, respiratorios, reproductivos y neurológicos, además de linfadenopatía y enfermedad debilitante.

Los anticuerpos pueden ser detectados usando Imunofluorescencia Indirecta (IFAT, por sus siglas en inglés), Fijación de Complemento, Ensayo de Inmunoabsorción Enzimática (ELISA, por sus siglas en inglés) e Counterinmunoeletroforesis (CIEP, por sus siglas en inglés).

USO PREVISTO

El enzimoinmunoensayo de NovaTec VetLine Anaplasma ELISA se utiliza para la determinación cualitativa de anticuerpos contra Anaplasma en suero de veterinario.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

La determinación inmunoenzimático cualitativa de anticuerpos específicos se basa en la técnica ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).

Las Placas de Microtitulación están recubiertas con antígenos específicos unen a los anticuerpos de la muestra. Después de lavar los pocillos para eliminar todo el material de muestra no unido, el conjugado de peroxidasa de rábano (HRP) se añade. Este conjugado se une a los anticuerpos capturados. En una segunda etapa de lavado se retira el conjugado no unido. El complejo inmune formado por el conjugado unido se visualizó añadiendo substrato tetrametilbencidina (TMB), que da un producto de reacción azul.

La intensidad de este producto es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos en la muestra. se añade ácido sulfúrico para detener la reacción. Esto produce un cambio de color de azul a amarillo. La extinción a 450/620 nm se mide con un fotómetro de Placa de Microtitulación ELISA.

REACTIVOS SUMINISTRADOS

• Placa de Microtitulación: 12 tiras de 8 pocillos rompibles, recubiertos con antígenos de Anaplasma, en bolsa de aluminio.
• Tampón de Dilución de Muestras: 1 botella de 100 mL de solución de tampón de fosfato (10 mM) para diluir la muestra; pH 7,2 ± 0,2; color amarillo; listo para ser utilizado; tapa blanca; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/MIT (3:1).
• Solución de Parada: 1 botella de 15 mL de ácido sulfúrico, 0,2 mol/L, listo para ser utilizado; tapa roja.
• Tampón de Lavado (20x conc.): 1 botella de 50 mL de una solución de tampón de fosfato 20x concentrado (0,2 M) para lavar los pocillos; pH 7,2 ± 0,2; tapa blanca.
• Conjugado: 1 botella de 20 mL Proteina A/G conjugada con peroxidasa de rábano (HRP); color amarillo; tapa blanca; listo para ser utilizado; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
• Solución de Sustrato de TMB: 1 botella de 15 mL 3,3´,5,5´-tetrametilbenzindina (TMB), < 0,1 %; listo para ser utilizado; tapa amarilla.
• Control Positivo: 1 botella de 2 mL control; color amarillo; tapa roja; listo para ser utilizado; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
• Control Cut-off: 1 botella de 3 mL control; color amarillo; tapa verde; listo para ser utilizado; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
• Control Negativo: 1 botella de 2 mL control; color amarillo; tapa azul; listo para ser utilizado; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/MIT (3:1).

ACCESORIOS SUMINISTRADOS

• 1 lámina autoadhesiva.
• 1 instrucciones de uso.
• 1 esquema de la placa.

MATERIALES E INSTRUMENTOS NECESARIOS

• Fotómetro de Placa de Microtitulación con filtros de 450/620 nm.
• Incubadora 37 °C.
• Dispositivo de lavado manual o automático para Placa de Microtitulación.
• Micropipetas para uso de (10-1000 µL).
• Mezcladora Vortex.
• Agua destilada.
• Tubos de plástico desechables.

ESTABILIDAD Y ALMACENAJE

Almacene el kit a 2…8 °C. Los reactivos abiertos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se almacena a 2…8 °C.

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Es muy importante llevar todos los reactivos y las muestras para a la temperatura ambiente (20…25 °C) y mezclarlos antes de serem utilizados!

Placa de Microtitulación
Las tiras rompibles están recubiertas con antígenos del Anaplasma; Inmediatamente después de la eliminación de las tiras, las tiras restantes deben sellarse de nuevo en el papel de aluminio junto con la bolsita di dióxio de silicio y almacenar a 2…8 °C.

Tampón de Lavado (20x conc.)
Diluir la Tampón de Lavado 1+19; por ejemplo 10 mL de la Tampón de Lavado + 190 mL de agua destilada. La Tampón de Lavado diluido es estable durante 5 días a temperatura ambiente o a 2…8 °C. Caso aparecen cristales en el concentrado, calentar la solución a 37 °C, por ejemplo, en un baño María. Mezclar bien antes de la dilución.

Solución de Sustrato de TMB
La solución está listo para su uso y debe almacenarse a 2…8 °C, protegida de la luz. La solución debe ser incolora o podría tener un color ligeramente azul claro. Si el sustrato se convierte en azul, es posible que haya sido contaminado y no puede ser utilizada en el ensayo.

TOMA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Usar muestras de suero canino con este ensayo. Si el ensayo se realiza dentro de 5 días después de la toma de sangre, las muestras pueden ser almacenadas de 2…8 °C, en caso contrario deben ser alicotadas y almacenadas congeladas (-70…-20 °C). Agitar bien las muestras descongeladas antes de diluirlas. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. No se recomienda la inactivación por calor de las muestras.

Dilución de las muestras
Antes del ensayo, las muestras tienen que estar diluidas en relación 1 + 100 con el Tampón de Dilución de Muestras, por ejemplo 10 µL de la muestra con 1 mL de Tampón de Dilución de Muestras, mezclar bien con la mezcladora Vortex.

PROCEDIMIENTO

Por favor, leer cuidadosamente las instrucciones de uso del ensayo antes de realizarlo. Para el buen funcionamiento de la técnica es necesario seguir las instrucciones. El siguiente procedimiento es válido solamente para el método manual. Si se realiza el ensayo en los sistemas automáticos de ELISA es aconsejable elevar el número de lavado de tres hasto cinco veces y el volumen de Tampón de Lavado de 300 ?L a 350 ?L para excluir efectos de lavado. Preste atención al capítulo 12. Antes de comenzar, especificar exactamente la repartición y posición de las muestras y de los estándares/controles (recomienda determinar en doble) en lo esquema de la placa suministrada. Usar la cantidad necesaria de tiras o pozos e insertarlos en el soporte.

Realizar el ensayo en el orden indicado y sin retraso.

Para cada paso de pipeteado en los estándares/controles y en las muestras, usar siempre puntas de pipeta de un solo uso.

Graduar la incubadora a 37 ? 1°C.

1. Pipetear 100 µL de estándares/controles y muestras en los pocillos respectivos. Dejar el pocillo A1 para el blanco.
2. Recubrir las tiras con los autoadhesivos suministrados.
3. Incubar 1 h ± 5 min a 37 ± 1°C.
4. Después de la incubación, retirar el autoadhesivo, aspirar el líquido de la tira y lavarla tres veces con 300 µL de la Tampón de Lavado. Evitar el rebosamiento de los pocillos. El intervalo entre lavado y aspiración debe ser > 5 segundos. Para sacar el líquido restante de las tiras, es conveniente sacudirlas sobre papel absorbente.
   Nota: El lavado es muy importante! Un mal lavado insuficiente provoca una baja precisión y resultados falsamente elevados!
5. Pipetar 100 µL de Conjugado en cada pocillo con excepción del blanco substrato A1.
6. Incubar 30 min a la temperatura ambiente (20 – 25 °C). Evitar la luz solar directa.
7. Repetir el lavado como en el paso numero 4.
8. Pipetar 100 µL de la Solución de Sustrato de TMB en todos los pocillos.
9. Incubar exactamente 15 min en oscuridad a temperatura ambiente (20…25 °C). Un color azul se produce en las muestras positivas debido a la reacción enzimática.
10. Pipetear en todos los pocillos 100 µL de la Solución de Parada en el mismo orden y mismo intervalo de tiempo como con la Solución de sustrato de TMB, por lo tanto un cambio de color de azul a amarillo se produce.
11. Medir la extinción con 450/620 nm en un periodo de 30 min después de añadir la Solución de Parada.

Medición
Ajustar el fotómetro de Placa de Microtitulación ELISA al cero utilizando el Blanco.

Si por razones técnicas el fotómetro de Placa de Microtitulación de ELISA no se pueder ajustar a cero utilizando el Blanco, el valor de la absorbancia desto debe ser sustraído de los demás valores de absorbancia medidos con el fin de obtener resultados fiables!.

Medir la extinción de todos los pocillos con 450 nm y anotar los resultados de los estándares/controles y de las muestras en la esquema de la placa.

Es aconsejable realizar la medición bicromática a una longitud de onda de referencia de 620 nm.

Si se efectuaron análisis en duplicado o múltiples, hay que calcular el promedio de los valores de extinción de los pocillos correspondientes.

CALCULO DE LOS RESULTADOS

Criterios de validez del ensayo

El ensayo es válido si se cumplen los siguientes criterios: