Simulación de detección del HIV por Western Blot, kit para 6 grupos de alumnos

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MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO

• Cubeta de electroforesis.
• Fuente de alimentación.
• Pipetas automáticas y puntas.
• Plataforma de agitación.
• Placa calefactora o microondas.
• Estufa de incubación (65ºC).
• Tubos de microcentrifuga.
• Cubeta de precipitación.
• Pipetas.
• Bandeja o recipiente que pueda contener una membrana de 7×7 cm y 100 ml de líquido.
• Guantes desechables.
• Envoltorio de plástico.
• Tijeras.
• Metanol, 95-100%.
• Ácido acético glacial.
• Agua destilada.
• Regla métrica.
• Probetas.
• Toallas de papel.

INTRODUCCIÓN

El Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una enfermedad caracterizada por el deterioro progresivo del sistema inmune de un individuo. El deterioro inmunológico permite que los agentes infecciosos, como virus, bacterias, hongos y parásitos que invaden el cuerpo y se propaguen. Además, la incidencia de ciertos tipos de cáncer aumenta dramáticamente en estos pacientes debido a tener su sistema inmune comprometido. El SIDA es una seria amenaza para la salud humana y es un problema global. La investigación intensiva se está haciendo para avanzar en los métodos de detección, tratamiento clínico y la prevención.

El virus del VIH
El agente etiológico del SIDA es el virus inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-1), un retrovirus. El VIH-1 contiene un genoma de ARN y una DNA-polimerasa ARN-dependiente denomina transcriptasa inversa. Los miembros de la familia de los retrovirus están involucrados en la patogénesis de ciertos tipos de leucemias y otros sarcomas en los seres humanos y animales. La estructura y el mecanismo de replicación del VIH son muy similares a otros retrovirus. El VIH es único en algunas de sus propiedades, ya que específicamente actúa sobre el sistema inmunológico, es muy inmunoevasivo, forma cantidades significativas de virus in vivo durante las etapas iniciales de la infección y pueden ser transmitidos durante la actividad sexual.

La partícula viral del VIH está rodeada de una bicapa lipídica derivada de la membrana celular del huésped. Las proteínas virales son identificadas por el prefijo GP (glicoproteína) o P (proteína) seguido de un número que indica el peso molecular aproximado, en kilodaltons. La bicapa lipídica contiene gp120 y gp41. Estas dos proteínas son productos proteolíticos de la precursora gp160. La gp41 ancla la gp120 en la bicapa. La proteína gp120 se utiliza habitualmente como un marcador de diagnóstico del VIH en el análisis de Western Blot. Más recientemente, también se han incluido otras glicoproteínas virales como marcadores para esta prueba. Debajo de la bicapa hay una cápside formada por p17 y p18. Dentro de esta cápside se encuentra el núcleo del virus. Las paredes del núcleo están formadas por p24 y p25. Dentro del núcleo hay dos moléculas idénticas de ARN, de 9800 nucleótidos de longitud. Los puentes de hidrogeno que unen las dos moléculas de ARN se forman a partir de una molécula de tRNA celular. El ARN viral está recubierto por moléculas de p7 y p9 fuertemente unidas. El núcleo también contiene, aproximadamente, 50 moléculas de transcriptasa inversa.

Hay varias proteínas virales cuya función exacta no se comprende totalmente. El virus puede hacerse crecer en cultivos de tejidos para el diagnóstico y la investigación. Varias de las proteínas virales han sido clonadas y obtenidas en cantidades relativamente grandes.

Un individuo puede recibir un inoculo de VIH a través de una abrasión en la mucosa superficial (por ejemplo, de genitales y paredes del recto), una transfusión de sangre, o por inyección intravenosa con una aguja contaminada. Los virus o las células infectadas por virus se encuentran en los fluidos corporales, como el semen y la sangre. El objetivo más importante para el virus son las células hematopoyéticas, como los monocitos, mielocitos y linfocitos derivados de la médula ósea. La infección de las células efectoras del sistema inmunitario, tales como las células T y los macrófagos, tiene en última instancia consecuencias clínicas muy importantes. La gp120 se une a los receptores CD4 en la superficie de células T ?helper? (TH). Estos receptores son glicoproteínas unidas a la membrana que participan en la activación de células T. En condiciones normales CD4 actúa como un receptor de membrana para el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC II) uniéndose a moléculas que están presentes en la superficie de los macrófagos y otros tipos de células. Las células TH son necesarias para las respuestas inmunológicas del cuerpo en general. La bicapa lipídica de los virus se fusionan con la de las membranas de las células y la cápside de proteínas virales pasa al interior de la célula por endocitosis. Después, la presencia de receptores CD4 disminuye y las gp120 aparecen en la superficie de la célula T. A través de un mecanismo complejo, la transcriptasa inversa sintetiza una copia de ADN de doble cadena a partir del ARN genómico. La molécula de ARNt actúa como cebador de la síntesis de la primera cadena. La actividad ARNasa H de la transcriptasa inversa degrada la cadena de ARN de la doble cadena ARN-ADN y la enzima sintetiza una hebra de ADN complementario. Las transcripciones inversas de ADN (ADN de doble cadena) migran hacia el núcleo de la célula donde se integran de forma covalente en el ADN genómico celular. La integración es catalizada en parte por las proteínas virales. La copia de ADN se integra mediante una vía específica, las secuencias de auto-conexión en ambos extremos se llaman repeticiones terminales largas (LTR). Estas secuencias también tienen funciones importantes en la transcripción viral. El ADN copiado e integrado se denomina material de ADN o provirus. El provirus entra en un período de latencia que puede durar varios años. El ADN proviral se replica junto con el ADN celular y puede ser heredada a través de muchas generaciones de células. El ADN proviral del VIH contiene los principales genes no transduccidos comunes a todos los retrovirus. Estos genes son gag, pol y env. VIH-1 también contiene cinco o seis genes más pequeños.

A diferencia de otras ADN polimerasas celulares, ADN polimerasa del VIH (transcriptasa inversa) tiene una alta tasa de errores. Estas frecuentes mutaciones cambian continuamente los epítopos de proteínas virales. Esto, se cree que es el principal mecanismo de immunoevasion del VIH. El gen gag se traduce en un polipéptido que se escinde por una proteasa viral en cuatro proteínas que forman las capas internas. La proteasa está codificada en el gen pol. El gen pol codifica la transcriptasa inversa y la integrasa, que es responsable de la incorporación genómico de la copia de ADN. El gen env codifica las glicoproteínas de superficie que las partículas virales adquieren a medida que infectan las células. La replicación viral es la causa de la destrucción de las células TH.

La técnica de ELISA es un importante método inmunoquímico utilizado para la detección de antígenos que se encuentran en niveles bajos. El ELISA se utiliza en la detección clínica del VIH en muestras de sangre. La técnica de ELISA para VIH detecta IgG circulantes del paciente dirigidos hacia los antígenos virales. Una reacción positiva en el ELISA requiere de otra prueba para su verificación definitiva, se realizaría mediante un Western Blot. El motivo para realizar esta prueba de verificación es que los anticuerpos pueden presentar a veces reacciones cruzadas.

Propiedades de las proteínas
La electroforesis en gel desnaturalizante SDS separa las proteínas en función de su tamaño. El SDS (dodecilsulfato de sodio) es un detergente que consiste en una cadena de hidrocarburo unida a un grupo sulfato altamente cargado negativamente. El SDS se une con fuerza a la mayoría de las proteínas y hace que la cadena se desenrolle en forma de varilla y tengan carga negativa neta. En ausencia de un agente desnaturalizante, como el 2-mercaptoetanol, los enlaces no covalentes se rompen en este proceso, aunque la composición de aminoácidos y la secuencia sigue siendo las mismas. Al perder la proteína su forma tridimensial también perderá su actividad biológica.

Las proteínas que han perdido su patrón de plegado especifico y su actividad biológica pero mantienen intactas sus cadenas de polipéptidos se llaman desnaturalizadas. Las proteínas que contienen varias cadenas de polipéptidos que tienen enlaces no covalentes serán disociadas por el SDS en cadenas polipeptídicas separadas, desnaturalizadas. Las proteínas pueden contener enlaces cruzados covalentes conocidos como uniones o puentes de disulfuro. Estos puentes están formados entre dos residuos de aminoácidos de cisteína que pueden estar localizados en la misma o en diferentes cadenas de polipéptidos. El tratamiento de proteínas a 100°C durante 3 minutos en presencia de altas concentraciones de agentes reductores, como el 2-mercaptoetanol, romperá los enlaces disulfuro. Esto permite al SDS disociar completamente y desnaturalizar la proteína.

Durante la electroforesis, las proteínas desnaturalizados con SDS migran a través del gel hacia el electrodo positivo a una velocidad que es inversamente proporcional a su peso molecular. Es decir, cuanto menor es la proteína, más rápido migra en el gel. El peso molecular de una proteína desconocida se obtiene al comparar su posición con respecto a la de las proteínas estándar desnaturalizadas con SDS después de realizar la electroforesis.

Análisis por Western Blot
El análisis por Western Blot implica la transferencia directa de bandas de proteínas a partir de un gel de agarosa o de poliacrilamida a una membrana de nailon cargada, para su análisis posterior. Después de la electroforesis, el gel se retira de la cubeta y la membrana de nailon se coloca directamente sobre el gel (las membranas de nailon son mucho más fuertes y flexibles que los geles y puede someterse a muchas manipulaciones sin desgarrarse.) Las bandas de proteínas se transfieren a la superficie de la membrana de nailon y se adsorben sobre la membrana por enlaces hidrófobos. Esta transferencia se logra por electroforesis en cámaras especialmente diseñadas, por flujo capilar o por la aplicación de vacío.

La proteína total transferida se puede visualizar con la tinción de la membrana con tintes de proteínas. La visualización de una proteína específica dentro de una mezcla de proteínas se detecta normalmente por métodos inmunoquímicos. Pero una proteína no puede ser detectada por tinción cuando su cantidad es demasiado baja o si queda encubierta por el resto de las bandas de la mezcla de proteínas.

Para la detección inmunológica de la proteína específica, se coloca una membrana sin teñir en un tampón de bloqueo, que contiene detergente y proteína que se unen a todos los sitios no ocupados sobre la membrana de nailon. La membrana se incuba después en un tampón que contiene anticuerpos a una (o más) de las proteínas buscadas.

El anticuerpo se une a la proteína adsorbida (antígeno) y los lavados posteriores eliminan los anticuerpos no unidos. Un anticuerpo secundario que esta covalentemente ligado a un enzima, como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante, se utiliza para la detección. Las condiciones para unir el enzima y el anticuerpo secundario no afecta la especificidad de unión con el antígeno, la afinidad del anticuerpo, o la actividad catalítica de la enzima.

La membrana se incuba a continuación en una solución de anticuerpo secundario, en donde se unirá selectivamente al complejo antígeno-anticuerpo primario. Después de este tratamiento, la membrana se lava para eliminar el complejo anticuerpo secundario-enzima no unido y se incubara en una solución que contiene un sustrato de fosfatasa o peroxidasa. Los productos obtenidos de la reacción enzimática son productos cromogénicos fácilmente visibles sobre la membrana de nailon.

En esta práctica, los estudiantes utilizarán un análisis por Western Blot modificado para detectar una proteína específica.

PREPARACIÓN DE LA PRÁCTICA

El objetivo de este experimento es entender los conceptos y metodología involucrados en la técnica de Western Blot. El experimento prueba la presencia de proteínas virales simuladas obtenidas a partir de cultivos de células infectadas con un hipotético suero de individuos seropositivos al VIH.

NOTA: ESTE EXPERIMENTO NO CONTIENE NINGUN MATERIAL PREPARADO A PARTIR DE FUENTES HUMANAS O DE VIRUS.

PRECAUCIONES

Llevar gafas y guantes de laboratorio mientras se trabaja.

NO PIPETEAR CON LA BOCA, utilizar los dispositivos adecuados.

Extremar las precauciones cuando se trabajan con equipos que utilizan conjuntamente calor y/o mezcla de reactivos.

Lavarse las manos con jabón y agua después de haber trabajado en el laboratorio o utilizado reactivos o materiales biológicos.

Tenga cuidado al usar cualquier equipo eléctrico en el laboratorio.

PREPARACIÓN DE LAS MEMBRANAS

En cualquier momento antes de la práctica en el laboratorio (necesario primer día).

Use guantes de laboratorio. Con los guantes puestos, lávese las manos y séqueselas. Los polvos de los guantes pueden interferir con el procedimiento.

1. Mantenga las membranas cubiertas por las hojas protectoras y asegúrese de que las hojas protectoras y la membrana están alineadas. Mantener la membrana cubierta de este modo durante todos los pasos siguientes.
2. Divida la membrana cubierta en seis piezas cuadradas de 7 x 7 cm dibujando las líneas con lápiz en la cubierta superior. Si está utilizando geles que son más pequeñas o más grandes de 7 x 7 cm debe ajustar las dimensiones al tamaño de los geles. También puede tener que ajustar los tamaños del papel filtro y las toallas de papel preparados para los estudiantes. En el caso de utilizar geles más grandes deberá realizar la práctica con un número menor de grupos.
3. Cortar las membranas cubiertas por las líneas dibujadas para obtener seis cuadrados. Asegúrese de que las hojas están alineados antes de cortar.
4. Almacenar las membranas cubiertos preparadas a temperatura ambiente hasta su uso.

PREPARACIÓN DE TAMPONES

El día de la práctica.

Tampón para la preparación del gel (Tampón Tris-glicina)
Solo se utiliza para la preparación de gel.

1. Añadir el polvo del tampón Tris-glicina a un matraz o vaso (500 ml tamaño o más grande).
2. Añadir 300 ml de agua destilada al polvo del tampón Tris-glicina. Remover y mantener la agitación hasta disolver completamente polvo del tampón Tris-glicina (utilizar una plataforma de agitación si dispone de una). Este es el Tampón 1x de Tris-glicina, listo para su uso en la preparación del gel(es).

Tampón de transferencia
(Necesario el primer día).

1. En 350 ml de agua destilada, añadir 50 ml de Tampón 10x de Tris-glicina-SDS.
2. Añadir 100 ml de 95-100% de metanol. Mezclar. Mantenga el tampón bien tapado a temperatura ambiente hasta su uso.

Tampón de electroforesis (Tampón Tris-glicina-SDS)

1. Añadir 1 parte de Tampón 10x EDVOTEK® Tris-glicina-SDS a 9 partes de agua destilada.
2. Hacer suficiente Tampón de electroforesis 1x para todas las unidades de electroforesis utilizadas.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE PROTEÍNA LIOFILIZADAS

El día de la práctica (necesario el primer día).

1. 1. Añadir 120 µl de agua destilada a cada tubo (A-E). Se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos. Agitar con vórtex o mezclar vigorosamente.
2. Calentar un vaso con agua, cubierto con papel de aluminio, hasta que hierva. Retirarlo de la fuente de calor.
3. Asegúrese de que los tubos de muestra (de A a E) están tapados herméticamente y bien marcados. Empujado a través de la lámina los tubos, de forma que la parte inferior de los tubos quede sumergido en el agua durante 5 minutos. Los tubos deben mantenerse suspendido en el agua por el papel de aluminio.
   NOTA: No debe poner en el agua caliente el marcador estándar de peso molecular (componente F).
4. Retire las muestras del agua, y golpe el tubo sobre la poyata o de un pulso breve con la microcentrífuga para depositar la totalidad del líquido de la muestra en el fondo del tubo.
5. Alicuotar 20 µl de cada muestra (A-E) para cada grupo de prácticas. Haga que los estudiantes carguen las muestras en el gel mientras están todavía calientes para evitar la agregación.
   NOTA: Cualquier resto de las muestras reconstituidas no utilizado se debe almacenar a -20°C. Si posteriormente necesita volver a utilizar estos restos de muestras, repita los pasos 2 a 4.

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TINCIÓN

Varios días antes de la práctica o el mismo día de la práctica (necesario el segundo día).

NOTA: No utilice recipientes de material acrílico para contener metanol, ya que puede destruirlos.

1. A 200 ml de agua destilada, añadir 250 ml de metanol absoluto y 55 ml de ácido acético glacial. Mezclar bien. Etiquetar como «Solución de tinción». Mantenerlo bien tapado a temperatura ambiente hasta su uso.
2. Verter la solución en una bandeja de vidrio. No utilice acrílico. Alcoholes, tales como el metanol, agrieta el material acrílico.

MATERIAL QUE DEBE RECIBIR CADA GRUPO

Primer día

• Componentes A-E (después del calentamiento, antes de alícuota).
• Componente F (sin calentar).
• Componentes para preparar gel de agarosa.
• Tampón de carga (opcional).
• 20-30 ml de Metanol 95-100%.
• Tampón de electroforesis (Tris-glicina-SDS), diluido.
• 80 ml de tampón de transferencia, diluido.
• 1 pieza de membrana de Western Blot.
• 3 piezas de papel de filtro.
• Toallas de papel.
• 1 envoltorio de plástico.
• Cubetas para remojar las membranas y geles (de material no acrílico).
• 20-30 ml de agua destilada.
• Pipetas y puntas.
• Vaso o recipiente de 400 ml (peso para realizar la transferencia).

Segundo día

• 50-75 ml de solución de tinción.
• 1 pieza de Protein InstaStain®.

ERRORES MÁS COMUNES

Los problemas potenciales que pueden aparecer es posible evitarlos siguiendo las sugerencias y recordatorios que figuran a continuación:

• Para asegurarse que las bandas de proteínas están bien definidas, asegúrese de que la formulación del gel es correcta y que la electroforesis se llevó a cabo durante el tiempo óptimo recomendado.
• Diluir el tampón concentrado correctamente para la preparación del gel y del tampón de electroforesis (utilizado en la cubeta). Recordar que sin tampón en el gel, no habrá la movilidad de la proteína. Utilice agua destilada para preparar tampones. No utilice agua del grifo.
• Para obtener resultados óptimos, utilice tampón de electroforesis y solución de tinción nuevos y preparados de acuerdo con las instrucciones.
• Antes de realizar la carga de las muestras en el gel, practicar la carga para evitar la dilución de las muestras con tampón durante la carga.
• Para evitar la pérdida de las bandas de proteínas en el tampón, asegúrese de que el gel se orienta correctamente para que las muestras no corran por el gel en la dirección equivocada durante la electroforesis.
• El marcador estándar utilizado en esta práctica es un colorante que no se transferirá a la membrana. Debe marcarse sobre la membrana antes de realizar la transferencia.

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

NOTA: Cuando se prepara el gel de agarosa al 2,5% de proteína, asegúrese de usar el 1x tampón Tris-glicina preparada por el profesor (NO UTILIZAR el Tampón 1x Tris-glicina-SDS como tampón en la realización del gel).

PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA AL 2,5%.

Determinar el volumen de agarosa requerido para su gel de agarosa al 2,5% en Tampón 1x Tris-glicina. Consulte la Tabla A para determinar volumen que necesita.