Descripción
OBJETIVO DEL EXPERIMENTO
El objetivo de esta práctica es realizar y dominar los conceptos experimentales y la metodología implicados en un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Este experimento ELISA está diseñado para detectar IgG circulantes diferentes dirigidas a dos antígenos diferentes. Las observaciones en esta práctica incluyen la especificidad de anticuerpos, el efecto de dilución sobre las reacciones de ELISA, el desarrollo del color y la cuantificación.
COMPONENTES
COMPONENTE |
CONSERVACIÓN |
A Antígeno A |
nevera
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B Antígeno B
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nevera
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C Tampón de dilución
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nevera
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D Anticuerpo primario A
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nevera
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E Anticuerpo primarioB
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nevera
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F 10X Tampón de Lavado
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nevera
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G Anticuerpo secundario
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nevera
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H ABTS
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nevera
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I Solución STOP
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nevera
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Placas de microtitulación
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Tª ambiente
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Pipetas de transferencia
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Tª ambiente
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Tubos de microcentrífuga
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Tª ambiente
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Tubos de plástico (15 ml y 50 ml)
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Tª ambiente
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NOTA: Tras la recepción, almacene los componentes perecederos (A-I) en la nevera.
NOTA: Ninguno de los componentes de este kit se ha preparado a partir de material humano.
NOTA: Todos los componentes de este kit están destinados a la investigación educativa. No pueden ser utilizados con fines de diagnóstico o médicos, ni pueden ser administrados o consumidos por seres humanos o animales.
MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO
- Agua destilada.
- Vasos de vidrio o matraces.
- Guantes desechables de laboratorio.
- Gafas protectoras.
- Micropipetas automáticas (5-50 µl) y (100-1000 µl) puntas.
INTRODUCCIÓN
Los anticuerpos son proteínas humanas y animales específicas que se producen por las células blancas de la sangre en respuesta a materiales extraños. Ejemplos de tales materiales extraños, conocidos como antígenos, incluyen agentes infecciosos y diversos materiales ambientales «no propios». Los antígenos biológicos son biomoléculas de elevado peso molecular, tales como proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos que pueden estar circulando libremente o como parte de un complejo, como parte de una cubierta de un virus o de la superficie celular bacteriana. Los anticuerpos son producidos en respuesta a antígenos. Se unen a los antígenos y juegan un papel significativo en la posterior eliminación de dichos materiales en circulación. Por ejemplo, la exposición a un agente infeccioso hace que el individuo inicie una respuesta inmune que finalmente resulta en moléculas de anticuerposen el plasma que se unen a diferentes proteínas virales (y/o diferentes áreas del mismo polipéptido).
Cuando un anticuerpo se une a un antígeno biológico específico, se pueden reconocer cargas químicas específicas, secuencias o elementos estructurales. Estas características de unión estructurales constituyen la huella digital específica para un antígeno. Cada molécula de anticuerpo puede unirse a dos moléculas de antígeno. Este reconocimiento y la unión es altamente específica y hace posible la diferenciación entre los dos virus circulantes que pueden estar muy estrechamente relacionados, como en el caso de dos cepas del mismo virus.
Cuando un antígeno y sus anticuerpos forman complejos insolubles, esta reacción de unión altamente específica es conocida como la inmunoprecipitación. La precipitación del complejo es el resultado de diversos anticuerpos policlonales que se unen a los antígenos para formar una red. En el ensayo de inmunoprecipitación tradicional, los anticuerpos se obtienen a partir del suero de un animal expuesto al antígeno específico. El suero, también conocida como plasma, se prepara por la eliminación de las células rojas de la sangre. Contiene las proteínas específicas, los anticuerpos, que actuan contra un antígeno particular «no propio» que se introduce en el animal, ya sea por diseño o por una infección. Los anticuerpos son purificados a partir de muestras de suero de los animales y se pueden utilizar para detectar antígenos particulares, tales como agentes infecciosos humanos.
Descripción de la prueba de detección inmunológica
Los enzimo-inmunoensayos (ELISA´s) fueron desarrollados originalmente para la medición de anticuerpos. Estos inmunoensayos también se han adaptado con éxito para detectar muestras que contienen antígenos. El ELISA se realiza en placas de microtitulación que generalmente están hechas de poliestireno o cloruro de polivinilo. Las placas son algo transparente y contienen muchos pozos pequeños (pocillos), en los que se depositan las muestras líquidas.
Los científicos agregan las muestras de prueba y los controles a los pocillos de la placa de plástico, donde no se adhieren específicamente a los pocillos a través de interacciones hidrofóbicas y electrostáticas (Figura 1). Esto significa que cualquier proteína en la muestra, y no solo el objetivo deseado, puede adherirse al plástico. A continuación, el anticuerpo primario se agrega a los pozos y la mezcla se deja incubar por un corto tiempo. Este anticuerpo reconoce específicamente y se une a la molécula objetivo (Figura 1). Por lo tanto, si alguna proteína objetivo está presente en los pocillos de microtitulación, el anticuerpo primario lo reconocerá.
Después de un breve período de incubación, los pocillos se lavan para eliminar cualquier anticuerpo primario que no se haya unido al antígeno. Después del lavado, se agrega un anticuerpo secundario unido a HRP a los pocillos donde se reconoce y se une al anticuerpo primario (Figura 1). El exceso de anticuerpo secundario se elimina de los pocillos lavando varias veces con tampón. Sin embargo, si el anticuerpo secundario se ha unido al anticuerpo primario, permanecerá en el pozo.

Finalmente, se agrega una solución de sustrato de ABTS y peróxido de hidrógeno a cada pozo. La enzima HRP ligada al anticuerpo secundario puede oxidar el ABTS en los pocillos donde está presente el complejo antígeno-anticuerpo, tornando la solución de sustrato transparente azul-verde.
Es importante destacar que la reacción enzima-sustrato solo puede ocurrir si cada paso del ELISA se realiza correctamente. Si la proteína objetivo no está presente en la solución de la muestra, o si la concentración es demasiado baja, los anticuerpos primarios y secundarios no tendrán nada con qué unirse y serán eliminados del pozo. Del mismo modo, incluso si el antígeno está presenteno se detectará si se utiliza el anticuerpo primario incorrecto. En cada uno de estos escenarios, no habrá enzima HRP disponible y el sustrato ABTS permanecerá incoloro.
Durante un ELISA cuantitativo, algunos de los pocillos contendrán soluciones donde ya se conoce la concentración del antígeno. Estas muestras se crean comúnmente al diluir el antígeno para crear una curva estándar que contiene un amplio rango de concentraciones de antígeno. La intensidad del sustrato en las muestras desconocidas se puede comparar con la curva estándar para determinar una concentración de antígeno aproximada.
En este experimento, se realizará un ELISA para examinar dos antígenos diferentes en muestras experimentales. El anticuerpo primario 1 solo detectará el antígeno A, mientras que el anticuerpo primario 2 es específico para el antígeno B. Ambos anticuerpos primarios pueden ser detectados por el mismo anticuerpo secundario. Se crearán curvas estándar para cada par de antígenos y anticuerpos para permitir una cuantificación precisa de las proteínas. Finalmente, se examinará la especificidad del ELISA intercambiando los pares antígeno-anticuerpo.
DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO
El objetivo de esta práctica es realizar y dominar los conceptos experimentales y la metodología implicados en un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los estudiantes realizarán un ELISA para detectar la concentración de dos antígenos diferentes. Se creará una curva estándar para cada antígeno para permitir una cuantificación precisa en muestras desconocidas.
PRECAUCIONES
Se deben usarlos guantes y gafas de protección de forma rutinaria como buenas prácticas de laboratorio.
Deben tener mucho cuidado al trabajar con equipos que utilizancalor y/o fusión de los reactivos.
NO PIPETEAR LOS REACTIVOS CON LA BOCA- PIPETEARCON PERAS DE SUCCIÓN.
Lavarse bien siempre las manos con agua y jabón después de manipular reactivos o materiales biológicos del laboratorio.
Tener cuidado al usar cualquier equipo eléctrico en el laboratorio.
REQUISITOS DE TIEMPO (APROXIMADO) DE LOS PROCEDIMIENTOS DE LA PRÁCTICA
Este experimento está destinado a ejecutarse en el transcurso de un único período de laboratorio y debe tomar aproximadamente 45-60 minutos. Si es necesario, el experimento se puede detener después del primer lavado. Indique a los estudiantes que agreguen tampón de lavado a cada pocillo de sus platos, cubran con cuidado con una envoltura de plástico o colóquelos en una bolsa de plástico para evitar la evaporación, y guarde las placas durante la noche a 4 ° C. No recomendamos almacenar las placas durante más de 24 horas antes de continuar con el experimento.
PREPARACIONES PREVIAS
Notas a los preparativos del profesor de la práctica
El tamaño de la clase, la duración de las clases de prácticas y la disponibilidad de los equipos son factores que deben ser considerados en la planificación e implementación de esta práctica con sus alumnos. Estas directrices pueden adaptarse para encajar en sus circunstancias específicas.
Preparación para |
Qué hacer |
Cuando |
Tiempo requerido |
Módulo I.ELISA Cuantitativo |
Dividir placas de microtitulación
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Antes del periodo de clases
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5 minutos
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Preparar y alícuotar reactivos
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Hasta 1 semana antes
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30 minutos
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Preparar anticuerpo secundario
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El mismo día
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10 minutos
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Cortar cada placa a lo largo de las líneas continuas como se muestra en la figura 3. Cada pieza contendrá 3 pocillos en un eje y 8 pocillos en el otro eje. Cada grupo de laboratorio recibirá dos piezas.
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