Descripción
OBJETIVO DEL EXPERIMENTO
En esta práctica, los estudiantes explorarán el proceso biológico de la transformación bacteriana utilizando E. coli y ADN plasmídico. Al finalizar la práctica, los estudiantes habrán experimentado la observación y el análisis de los rasgos adquiridos (resistencia a la ampicilina y pigmentación) como lo demuestran las células bacterianas transformadas.
COMPONENTES
Componentes |
Conservación |
A. ADN plasmídico pChromoBlueTM |
-20 ºC
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B. ADN plasmídico pChromoPinkTM
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-20 ºC
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C. ADN plasmídico pChromoPurpleTM
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-20 ºC
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D. Ampicilina
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-20 ºC
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E. IPTG
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-20 ºC
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F. CaCl
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-20 ºC
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G. Competent Cell Solution
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-20 ºC
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BactoBeadsTM (con desecante incluido)
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4 ºC
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Botella Luria Broth Medio para recuperación (o «caldo de recuperación»), estéril
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Botella ReadyPourTM Luria Broth Agar (o «ReadyPour Agar»), estéril
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Placas de Petri, pequeñas
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Placas de Petri, grandes
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Pipetas de plástico para transferencia
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Pipetas de 10 ml, estériles
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Asas de siembra, estériles
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Tubos cónicos
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Tubos de microcentrífuga
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NOTAS:
Tras la recepción, almacene los componentes de este kit a las temperaturas indicadas en este protocolo.
Ninguno de los componentes de este kit se ha preparado a partir de material humano.
Todos los componentes de este kit están destinados a la investigación educativa. No pueden ser utilizados con fines de diagnóstico o médicos, ni pueden ser administrados o consumidos por seres humanos o animales.
MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO
- Micropipetas automáticas (5-50 μl) y puntas.
- Microcentrifuga. Para la transfromación «Enhanced».
- Dos baños de agua (37 ºC y 42 ºC).
- Estufa de incubación (para temperaturas de 37 °C).
- Guantes desechables de laboratorio.
- Gafas protectoras.
- Rotuladores/marcadores.
- Bomba o pera de succión para pipetear.
- Recipiente/vaso para hielo y hielo.
- Quemador Bunsen, placa caliente u horno microondas.
- Guantes de protección para calor.
- Termómetro.
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
EL ADN PUEDE SER TRANSFERIDO ENTRE BACTERIAS En la naturaleza, el ADN se transfiere entre bacterias utilizando dos métodos principales: transformación y conjugación. En la transformación, una bacteria toma el ADN exógeno del entorno (Figura 1). Por el contrario, la conjugación depende del contacto directo entre dos células bacterianas. Un pedazo de ADN se copia en una célula (el donante) y luego se transfiere a la otra célula (receptor). En ambos casos, las bacterias han adquirido nueva información genética que es a la vez estable y heredable.
Frederick Griffith descubrió por primera vez la transformación en 1928 cuando observó que los cultivos vivos de una cepa de Streptococcus pneumonia, normalmente no patógena, eran capaces de matar a los ratones, pero sólo después de haber sido mezclados con una cepa patógena muerta por calor. Debido a que la cepa no patógena había sido «transformada» en una cepa patógena, llamó a esta transferencia de virulencia «transformación». En 1944, Oswald Avery y sus colegas purificaron el ADN, el ARN y la proteína de una cepa virulenta de S. pneumonia para determinar cuál era responsable de la transformación. Cada componente se mezcló con una cepa no patógena de bacterias. Sólo las células receptoras expuestas al ADN se volvieron patogénicas. Estos experimentos de transformación no sólo revelaron cómo se transfiere esta virulencia, sino que también condujeron al reconocimiento del ADN como material genético.
El modo exacto de transformación puede diferir entre las especies de bacterias. Por ejemplo, Haemophilus influenzae usa vesículas unidas a membrana para capturar ADN de doble cadena del medio ambiente. En contraste, S. pneumoniae expresa factores de competencia que permiten a las células captar moléculas de ADN de cadena sencilla. En el laboratorio, los científicos pueden inducir a las células -incluso aquellas que no son naturalmente competentes- a tomar ADN y transformarse. Para lograr esto, el ADN se añade a las células en presencia de productos químicos específicos (como el calcio, el rubidio o el cloruro de magnesio), y la suspensión es sometida a un «choque térmico» – se realizan cambios rápidos entre temperaturas muy diferentes. Se cree que una combinación de iones químicos y el cambio rápido de temperatura altera la permeabilidad de la pared celular y la membrana, permitiendo que las moléculas de ADN entren en la célula. Hoy en día, muchos biólogos moleculares usan la transformación de Escherichia coli en sus experimentos, aunque normalmente no es capaz de transformarse en la naturaleza.
INGENIERÍA GENÉTICA UTILIZANDO TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE
Muchas bacterias poseen genes extra, no esenciales, en pequeños trozos circulares de ADN bicatenario además de su ADN cromosómico. Estos fragmentos de ADN, llamados plásmidos, permiten a las bacterias intercambiar genes beneficiosos. Por ejemplo, el gen que codifica la ß-lactamasa, una enzima que proporciona resistencia a los antibióticos, puede ser transferido entre bacterias en los plásmidos. Las células transformadas segregan ß-lactamasa en el medio circundante, donde degrada el antibiótico ampicilina, que inhibe el crecimiento celular al interferir con la síntesis de la pared celular. Por lo tanto, las bacterias que expresan este gen pueden crecer en presencia de ampicilina. Además, pequeñas colonias «satélites» de células no transformadas también pueden crecer alrededor de colonias transformadas porque están indirectamente protegidas por ß-lactamasa.
La tecnología del ADN recombinante ha permitido a los científicos vincular genes de diferentes fuentes a plásmidos bacterianos (Figura 2). Estos plásmidos especializados, denominados vectores, contienen las siguientes características:
- Origen de la replicación: una secuencia de ADN a partir de la cual las bacterias pueden iniciar la copia del plásmido.
- Sitio de clonación múltiple: una secuencia corta de ADN que contiene muchos sitios únicos de enzimas de restricción y permite a los científicos controlar la introducción de genes específicos en el plásmido.
- Promotor: una secuencia de ADN que se encuentra normalmente justo antes («arriba» de) la secuencia codificante de un gen. El promotor recluta ARN polimerasa al comienzo de la secuencia génica, donde puede comenzar la transcripción.
- Marcador seleccionable: un gen que codifica la resistencia a un antibiótico específico (generalmente ampicilina, kanamicina o tetraciclina). Cuando se utilizan medios selectivos, sólo las células que contienen el marcador deben crecer en colonias, lo que permite a los investigadores identificar fácilmente las células que se han transformado con éxito.
EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN
En la práctica, la transformación es altamente ineficiente, sólo una de cada 10.000 células incorpora con éxito el ADN del plásmido. Sin embargo, debido a que muchas células se usan en un experimento de transformación (aproximadamente 1×109 células), sólo un pequeño número de células debe ser transformado para lograr un resultado positivo. Si las bacterias se transforman con un plásmido que contiene un marcador seleccionable y se siembran en medio de agar selectivo y no selectivo, observaremos resultados muy diferentes. Las placas de agar no selectivas permitirán que las bacterias transformadas y no transformadas crezcan, formando un «césped» bacteriano. Por el contrario, en la placa de agar selectiva, sólo las células transformadas que expresan el marcador crecerán, dando como resultado la recuperación de colonias aisladas.
Debido a que cada colonia se origina a partir de una sola célula transformada, podemos calcular la eficiencia de transformación, o el número de células transformadas por microgramo (μg) de ADN plasmídico (esbozado en la Figura 3). Por ejemplo, si se utilizaron 10 nanogramos (0,01 μg) de plásmido para transformar un mililitro (ml) de células, y colocando 0,1 ml de esta mezcla (100 microlitros, o 100 μl) da lugar a 100 colonias, entonces debe haber habido 1.000 bacterias en la mezcla de 1 ml. La división de 1.000 transformantes por μg de ADN significa que la eficiencia de transformación sería de 1×105 células transformadas por μg de ADN plasmídico. La eficiencia de transformación varía generalmente de 1×105 a 1×108 células transformadas por μg de plásmido.
USO DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES Y CROMOGÉNICAS EN BIOTECNOLOGÍA
Las proteínas marcadoras fluorescentes se han convertido en una herramienta esencial en la biología celular y molecular. La proteína fluorescente más conocida, Green Fluorescent Protein (o GFP), posee la capacidad de absorber luz azul y emitir luz verde en respuesta sin necesidad de ningún sustrato especial adicional, productos génicos o cofactores. Las proteínas fluorescentes se han convertido en una herramienta esencial en la biología celular y molecular. Usando estrategias de clonación de ADN, las proteínas pueden ser «marcadas» con proteínas fluorescentes y luego expresadas en células. Estos marcajes simplifican la purificación porque las proteínas marcadas fluorescentemente pueden ser rastreadas usando luz UV.
La aplicación más útil de GFP es como una herramienta de visualización durante estudios de microscopía fluorescente. Usando técnicas de ingeniería genética, los científicos han introducido la secuencia de ADN para GFP en otros organismos, como E. coli y el nematodo Caenorhabditis elegans. Marcando las proteínas in vivo, los investigadores pueden determinar dónde se encuentran normalmente esas proteínas en la célula. Del mismo modo, los científicos pueden observar los procesos biológicos como ocurren dentro de las células vivas. Usando una proteína fluorescente como marcador, los científicos pueden observar procesos biológicos como ocurren dentro de las células vivas. Por ejemplo, en el organismo modelo del pez cebra (Danio rerio), los científicos usan GFP para etiquetar fluorescentemente las proteínas de los vasos sanguíneos para que puedan rastrear los patrones de crecimiento de los vasos sanguíneos y sus conexiones. La GFP y la microscopía fluorescente han mejorado nuestra comprensión de muchos procesos biológicos permitiendo a los científicos ver los procesos biológicos en tiempo real.
Recientemente, los biólogos sintéticos han diseñado una variedad de proteínas que se utilizarán en lugar de GFP. En primer lugar, los científicos buscaron en una base de datos de secuencias de ADN para identificar genes que se prevé que produjeran proteínas de color. Fragmentos de estos genes se unieron entre sí para crear pequeñas proteínas quiméricas (de aproximadamente 27 kilodaltons de tamaño). Estos nuevos genes se clonaron en un plásmido y se transformaron en E. coli. Cuando se examinaron las células, los biólogos sintéticos habían creado una gran variedad de proteínas fluorescentes que serían útiles para experimentos de biología. Curiosamente, los científicos también habían creado varios genes quiméricos que produjeron células altamente pigmentadas. Estas coloridas proteínas cromogénicas eran visibles a simple vista, lo que significa que ya no eran necesarios una fuente de luz UV o un microscopio fluorescente para la visualización. Las proteínas cromógenas ya se utilizan en la biotecnología como controles para la expresión de proteínas y como marcadores visuales para la purificación de proteínas. A medida que la tecnología se hace más común, pueden convertirse en marcadores importantes para estudios de expresión génica in vivo.
CONTROL DE LA EXPRESION GENICA
Los científicos pueden regular la expresión de proteínas recombinantes utilizando un interruptor genético «on/off» llamado promotor inducible (Figura 4). Estas secuencias permiten un control preciso porque la expresión del gen sólo se «activará» en presencia de una molécula pequeña como arabinosa, tetraciclina o IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosido).
En este experimento, los plásmidos que vamos a utilizar para transformar nuestra E. coli han sido diseñados para contener la secuencia de ADN de las proteínas cromógenas azules, rosadas o púrpuras (pChromoBlue, pChromoPink y pChromoPurple). La expresión de estas proteínas cromogénicas está bajo el control de un promotor inducible. Las bacterias huésped han sido modificadas genéticamente para contener el gen de una ARN polimerasa especial (polimerasa T7), que está controlada por el promotor lac. Bajo circunstancias normales, las bacterias producen una proteína llamada represor lac, que se une a este promotor y bloquea la expresión de la polimerasa T7. Sin polimerasa T7, la proteína cromogénica no puede ser expresada, y las células no fluorescen. Sin embargo, cuando se añade IPTG, el represor lac es inactivado y se expresa la polimerasa T7. Esta polimerasa reconoce específicamente el promotor en el plásmido que contiene proteína cromogénica y transcribe grandes cantidades de mRNA. Finalmente, el ARNm se traduce para producir proteínas azules, rosadas o púrpuras, haciendo que las células sean pigmentadas.
DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
En esta práctica, E. coli químicamente competente se transformará con una mezcla de plásmidos que contienen genes para ampicilina y una proteína cromogénica (rosa, morado o azul). Los transformantes se seleccionarán para la presencia de plásmido usando placas de LB-ampicilina, y se calculará la eficiencia de transformación. Además, algunas células estarán expuestas al IPTG, mientras que otras no estarán expuestas al IPTG. Dado que las proteínas cromógenas azules, rosadas y púrpuras sólo se expresarán en presencia de la molécula de IPTG, esta práctica demostrará la expresión génica diferencial. Al finalizar la práctica, los estudiantes habrán observado y analizado los rasgos adquiridos (resistencia a la ampicilina y pigmentación) que muestran las células bacterianas transformadas. Los estudiantes también deben haber mejorado su comprensión de los conceptos abstractos de transformación y expresión génica.
¡¡NOTA MUY IMPORTANTE!!: Los experimentos de transformación contienen antibióticos que se utilizan para la selección de bacterias transformadas. Los estudiantes que tienen alergias a antibióticos como la penicilina, la ampicilina u otros antibióticos relacionados no deben participar en esta práctica.
PREPARACIONES PREVIAS
Qué hacer |
Tiempo requerido |
¿Cuando? |
Preparar placas Agar LB. |
1 hora
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2-7 días antes de usarlas.
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Preparar las placas de E.Coli fuentes.
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20 minutos para sembrar las placas. 16-18 horas para incubar las placas
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El día antes de realizar la práctica.
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Dispensar el ADN plasmídico, CaCl2 y el caldo de recuperación.
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30 minutos
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De 1 día a 30 minutos antes de realizar la práctica.
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