Transformación Multicolor, kit para 10 grupos de alumnos

En esta práctica, los estudiantes transformarán las bacterias con plásmidos multicolor que convertirán las células bacterianas (no patógenas) en células brillantes y coloridas.

181,50 

Disponible para reserva

Referencia: TRANS3

Descripción

OBJETIVO DEL EXPERIMENTO

En esta práctica, los estudiantes explorarán el proceso biológico de la transformación bacteriana utilizando E. coli y ADN plasmídico. Al finalizar la práctica, los estudiantes habrán experimentado la observación y el análisis de los rasgos adquiridos (resistencia a la ampicilina y pigmentación) como lo demuestran las células bacterianas transformadas.

Trans3

COMPONENTES

Componentes Conservación
A. ADN plasmídico pChromoBlueTM
-20 ºC
B. ADN plasmídico pChromoPinkTM
-20 ºC
C. ADN plasmídico pChromoPurpleTM
-20 ºC
D. Ampicilina
-20 ºC
E. IPTG
-20 ºC
F. CaCl
-20 ºC
G. Competent Cell Solution
-20 ºC
BactoBeadsTM (con desecante incluido)
4 ºC
Botella Luria Broth Medio para recuperación (o «caldo de recuperación»), estéril
Botella ReadyPourTM Luria Broth Agar (o «ReadyPour Agar»), estéril
Placas de Petri, pequeñas
Placas de Petri, grandes
Pipetas de plástico para transferencia
Pipetas de 10 ml, estériles
Asas de siembra, estériles
Tubos cónicos
Tubos de microcentrífuga

NOTAS:
Tras la recepción, almacene los componentes de este kit a las temperaturas indicadas en este protocolo.
Ninguno de los componentes de este kit se ha preparado a partir de material humano.
Todos los componentes de este kit están destinados a la investigación educativa. No pueden ser utilizados con fines de diagnóstico o médicos, ni pueden ser administrados o consumidos por seres humanos o animales.

MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO

  • Micropipetas automáticas (5-50 μl) y puntas.
  • Microcentrifuga. Para la transfromación «Enhanced».
  • Dos baños de agua (37 ºC y 42 ºC).
  • Estufa de incubación (para temperaturas de 37 °C).
  • Guantes desechables de laboratorio.
  • Gafas protectoras.
  • Rotuladores/marcadores.
  • Bomba o pera de succión para pipetear.
  • Recipiente/vaso para hielo y hielo.
  • Quemador Bunsen, placa caliente u horno microondas.
  • Guantes de protección para calor.
  • Termómetro.

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

EL ADN PUEDE SER TRANSFERIDO ENTRE BACTERIAS En la naturaleza, el ADN se transfiere entre bacterias utilizando dos métodos principales: transformación y conjugación. En la transformación, una bacteria toma el ADN exógeno del entorno (Figura 1). Por el contrario, la conjugación depende del contacto directo entre dos células bacterianas. Un pedazo de ADN se copia en una célula (el donante) y luego se transfiere a la otra célula (receptor). En ambos casos, las bacterias han adquirido nueva información genética que es a la vez estable y heredable.

Trans3-1

 

Frederick Griffith descubrió por primera vez la transformación en 1928 cuando observó que los cultivos vivos de una cepa de Streptococcus pneumonia, normalmente no patógena, eran capaces de matar a los ratones, pero sólo después de haber sido mezclados con una cepa patógena muerta por calor. Debido a que la cepa no patógena había sido «transformada» en una cepa patógena, llamó a esta transferencia de virulencia «transformación». En 1944, Oswald Avery y sus colegas purificaron el ADN, el ARN y la proteína de una cepa virulenta de S. pneumonia para determinar cuál era responsable de la transformación. Cada componente se mezcló con una cepa no patógena de bacterias. Sólo las células receptoras expuestas al ADN se volvieron patogénicas. Estos experimentos de transformación no sólo revelaron cómo se transfiere esta virulencia, sino que también condujeron al reconocimiento del ADN como material genético.

El modo exacto de transformación puede diferir entre las especies de bacterias. Por ejemplo, Haemophilus influenzae usa vesículas unidas a membrana para capturar ADN de doble cadena del medio ambiente. En contraste, S. pneumoniae expresa factores de competencia que permiten a las células captar moléculas de ADN de cadena sencilla. En el laboratorio, los científicos pueden inducir a las células -incluso aquellas que no son naturalmente competentes- a tomar ADN y transformarse. Para lograr esto, el ADN se añade a las células en presencia de productos químicos específicos (como el calcio, el rubidio o el cloruro de magnesio), y la suspensión es sometida a un «choque térmico» – se realizan cambios rápidos entre temperaturas muy diferentes. Se cree que una combinación de iones químicos y el cambio rápido de temperatura altera la permeabilidad de la pared celular y la membrana, permitiendo que las moléculas de ADN entren en la célula. Hoy en día, muchos biólogos moleculares usan la transformación de Escherichia coli en sus experimentos, aunque normalmente no es capaz de transformarse en la naturaleza.

INGENIERÍA GENÉTICA UTILIZANDO TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE
Muchas bacterias poseen genes extra, no esenciales, en pequeños trozos circulares de ADN bicatenario además de su ADN cromosómico. Estos fragmentos de ADN, llamados plásmidos, permiten a las bacterias intercambiar genes beneficiosos. Por ejemplo, el gen que codifica la ß-lactamasa, una enzima que proporciona resistencia a los antibióticos, puede ser transferido entre bacterias en los plásmidos. Las células transformadas segregan ß-lactamasa en el medio circundante, donde degrada el antibiótico ampicilina, que inhibe el crecimiento celular al interferir con la síntesis de la pared celular. Por lo tanto, las bacterias que expresan este gen pueden crecer en presencia de ampicilina. Además, pequeñas colonias «satélites» de células no transformadas también pueden crecer alrededor de colonias transformadas porque están indirectamente protegidas por ß-lactamasa.

La tecnología del ADN recombinante ha permitido a los científicos vincular genes de diferentes fuentes a plásmidos bacterianos (Figura 2). Estos plásmidos especializados, denominados vectores, contienen las siguientes características:

Trans3-2

  1. Origen de la replicación: una secuencia de ADN a partir de la cual las bacterias pueden iniciar la copia del plásmido.
  2. Sitio de clonación múltiple: una secuencia corta de ADN que contiene muchos sitios únicos de enzimas de restricción y permite a los científicos controlar la introducción de genes específicos en el plásmido.
  3. Promotor: una secuencia de ADN que se encuentra normalmente justo antes («arriba» de) la secuencia codificante de un gen. El promotor recluta ARN polimerasa al comienzo de la secuencia génica, donde puede comenzar la transcripción.
  4. Marcador seleccionable: un gen que codifica la resistencia a un antibiótico específico (generalmente ampicilina, kanamicina o tetraciclina). Cuando se utilizan medios selectivos, sólo las células que contienen el marcador deben crecer en colonias, lo que permite a los investigadores identificar fácilmente las células que se han transformado con éxito.

EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN
En la práctica, la transformación es altamente ineficiente, sólo una de cada 10.000 células incorpora con éxito el ADN del plásmido. Sin embargo, debido a que muchas células se usan en un experimento de transformación (aproximadamente 1×109 células), sólo un pequeño número de células debe ser transformado para lograr un resultado positivo. Si las bacterias se transforman con un plásmido que contiene un marcador seleccionable y se siembran en medio de agar selectivo y no selectivo, observaremos resultados muy diferentes. Las placas de agar no selectivas permitirán que las bacterias transformadas y no transformadas crezcan, formando un «césped» bacteriano. Por el contrario, en la placa de agar selectiva, sólo las células transformadas que expresan el marcador crecerán, dando como resultado la recuperación de colonias aisladas.

Debido a que cada colonia se origina a partir de una sola célula transformada, podemos calcular la eficiencia de transformación, o el número de células transformadas por microgramo (μg) de ADN plasmídico (esbozado en la Figura 3). Por ejemplo, si se utilizaron 10 nanogramos (0,01 μg) de plásmido para transformar un mililitro (ml) de células, y colocando 0,1 ml de esta mezcla (100 microlitros, o 100 μl) da lugar a 100 colonias, entonces debe haber habido 1.000 bacterias en la mezcla de 1 ml. La división de 1.000 transformantes por μg de ADN significa que la eficiencia de transformación sería de 1×105 células transformadas por μg de ADN plasmídico. La eficiencia de transformación varía generalmente de 1×105 a 1×108 células transformadas por μg de plásmido.

Trans3-3

USO DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES Y CROMOGÉNICAS EN BIOTECNOLOGÍA
Las proteínas marcadoras fluorescentes se han convertido en una herramienta esencial en la biología celular y molecular. La proteína fluorescente más conocida, Green Fluorescent Protein (o GFP), posee la capacidad de absorber luz azul y emitir luz verde en respuesta sin necesidad de ningún sustrato especial adicional, productos génicos o cofactores. Las proteínas fluorescentes se han convertido en una herramienta esencial en la biología celular y molecular. Usando estrategias de clonación de ADN, las proteínas pueden ser «marcadas» con proteínas fluorescentes y luego expresadas en células. Estos marcajes simplifican la purificación porque las proteínas marcadas fluorescentemente pueden ser rastreadas usando luz UV.

La aplicación más útil de GFP es como una herramienta de visualización durante estudios de microscopía fluorescente. Usando técnicas de ingeniería genética, los científicos han introducido la secuencia de ADN para GFP en otros organismos, como E. coli y el nematodo Caenorhabditis elegans. Marcando las proteínas in vivo, los investigadores pueden determinar dónde se encuentran normalmente esas proteínas en la célula. Del mismo modo, los científicos pueden observar los procesos biológicos como ocurren dentro de las células vivas. Usando una proteína fluorescente como marcador, los científicos pueden observar procesos biológicos como ocurren dentro de las células vivas. Por ejemplo, en el organismo modelo del pez cebra (Danio rerio), los científicos usan GFP para etiquetar fluorescentemente las proteínas de los vasos sanguíneos para que puedan rastrear los patrones de crecimiento de los vasos sanguíneos y sus conexiones. La GFP y la microscopía fluorescente han mejorado nuestra comprensión de muchos procesos biológicos permitiendo a los científicos ver los procesos biológicos en tiempo real.

Recientemente, los biólogos sintéticos han diseñado una variedad de proteínas que se utilizarán en lugar de GFP. En primer lugar, los científicos buscaron en una base de datos de secuencias de ADN para identificar genes que se prevé que produjeran proteínas de color. Fragmentos de estos genes se unieron entre sí para crear pequeñas proteínas quiméricas (de aproximadamente 27 kilodaltons de tamaño). Estos nuevos genes se clonaron en un plásmido y se transformaron en E. coli. Cuando se examinaron las células, los biólogos sintéticos habían creado una gran variedad de proteínas fluorescentes que serían útiles para experimentos de biología. Curiosamente, los científicos también habían creado varios genes quiméricos que produjeron células altamente pigmentadas. Estas coloridas proteínas cromogénicas eran visibles a simple vista, lo que significa que ya no eran necesarios una fuente de luz UV o un microscopio fluorescente para la visualización. Las proteínas cromógenas ya se utilizan en la biotecnología como controles para la expresión de proteínas y como marcadores visuales para la purificación de proteínas. A medida que la tecnología se hace más común, pueden convertirse en marcadores importantes para estudios de expresión génica in vivo.

CONTROL DE LA EXPRESION GENICA
Los científicos pueden regular la expresión de proteínas recombinantes utilizando un interruptor genético «on/off» llamado promotor inducible (Figura 4). Estas secuencias permiten un control preciso porque la expresión del gen sólo se «activará» en presencia de una molécula pequeña como arabinosa, tetraciclina o IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosido).

Trans3-4

En este experimento, los plásmidos que vamos a utilizar para transformar nuestra E. coli han sido diseñados para contener la secuencia de ADN de las proteínas cromógenas azules, rosadas o púrpuras (pChromoBlue, pChromoPink y pChromoPurple). La expresión de estas proteínas cromogénicas está bajo el control de un promotor inducible. Las bacterias huésped han sido modificadas genéticamente para contener el gen de una ARN polimerasa especial (polimerasa T7), que está controlada por el promotor lac. Bajo circunstancias normales, las bacterias producen una proteína llamada represor lac, que se une a este promotor y bloquea la expresión de la polimerasa T7. Sin polimerasa T7, la proteína cromogénica no puede ser expresada, y las células no fluorescen. Sin embargo, cuando se añade IPTG, el represor lac es inactivado y se expresa la polimerasa T7. Esta polimerasa reconoce específicamente el promotor en el plásmido que contiene proteína cromogénica y transcribe grandes cantidades de mRNA. Finalmente, el ARNm se traduce para producir proteínas azules, rosadas o púrpuras, haciendo que las células sean pigmentadas.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA

En esta práctica, E. coli químicamente competente se transformará con una mezcla de plásmidos que contienen genes para ampicilina y una proteína cromogénica (rosa, morado o azul). Los transformantes se seleccionarán para la presencia de plásmido usando placas de LB-ampicilina, y se calculará la eficiencia de transformación. Además, algunas células estarán expuestas al IPTG, mientras que otras no estarán expuestas al IPTG. Dado que las proteínas cromógenas azules, rosadas y púrpuras sólo se expresarán en presencia de la molécula de IPTG, esta práctica demostrará la expresión génica diferencial. Al finalizar la práctica, los estudiantes habrán observado y analizado los rasgos adquiridos (resistencia a la ampicilina y pigmentación) que muestran las células bacterianas transformadas. Los estudiantes también deben haber mejorado su comprensión de los conceptos abstractos de transformación y expresión génica.

¡¡NOTA MUY IMPORTANTE!!: Los experimentos de transformación contienen antibióticos que se utilizan para la selección de bacterias transformadas. Los estudiantes que tienen alergias a antibióticos como la penicilina, la ampicilina u otros antibióticos relacionados no deben participar en esta práctica.

PREPARACIONES PREVIAS

Qué hacer Tiempo requerido ¿Cuando?
Preparar placas Agar LB.
1 hora
2-7 días antes de usarlas.
Preparar las placas de E.Coli fuentes.
20 minutos para sembrar las placas. 16-18 horas para incubar las placas
El día antes de realizar la práctica.
Dispensar el ADN plasmídico, CaCl2 y el caldo de recuperación.
30 minutos
De 1 día a 30 minutos antes de realizar la práctica.

DÍA DEL EXPERIMENTO

Qué hacer Tiempo requerido ¿Cuando?
Equilibrar los baños de agua a 37ºC y 42ºC, y la estufa de incubación a 37ºC.
10 minutos
De 1 a 2 horas antes de realizar la práctica.
Preparar el Cultivo Inicial de E.coli
5 minutos
1h incubación
De 1 a 2 horas antes de realizar la práctica.
Incubar las células a 37ºC.
24 horas
Durante toda la noche.

RESULTADOS Y LIMPIEZA

Qué hacer Tiempo requerido ¿Cuando?
Observar los resultados de la práctica y calcular la eficiencia de la transformación.
50 minutos
La siguiente clase de prácticas.
Desechar los materiales contaminados.
De 45 minutos
Después de analizar los resultados

NOTAS A LOS PREPARATIVOS DEL PROFESOR DE LA PRÁCTICA

El tamaño de la clase, la duración de las clases de prácticas y la disponibilidad de los equipos son factores que deben ser considerados en la planificación e implementación de esta práctica con sus alumnos. Estas directrices pueden adaptarse para encajar con sus circunstancias específicas.

Libreta de laboratorio:
Los científicos documentan todo lo que ocurre durante un experimento, incluyendo condiciones experimentales, pensamientos y observaciones durante la realización del experimento, y, por supuesto, cualquier información recopilada. Hoy, los estudiantes deberán documentar su experimento/práctica en una libreta de laboratorio o en una hoja de trabajo separada.

Registro de las actividades de laboratorio
Los alumnos deben registrar en su libreta de prácticas las actividades indicadas a continuación.

Antes de iniciar la práctica:

  • Leer atentamente la introducción y el protocolo. Utilizar esta información para escribir una hipótesis que refleje la práctica.
  • Predecir los resultados experimentales.

Durante la práctica:

  •  Registrar (dibujar) sus observaciones, o fotografiar los resultados.

Al finalizar la práctica:

  • Interpretar los resultados, ¿los datos recopilados apoyan o contradicen la hipótesis inicial?
  • En caso de repetir el experimento, ¿qué cambio realizaría?.
  • Revisar la hipótesis inicial para que refleje este cambio.

PREPARATIVOS ANTES DE LA PRÁCTICAPLACAS DE AGAR DE LB

Una botella de agar de caldo Luria de ReadyPour™ preparar 5 placas fuente LB grandes, 10 placas (pequeñas) LB, 20 placas (pequeñas) LB/Amp y 10 placas (pequeñas) LB/Amp/IPTG.

Use guantes de protección para el calor y gafas de seguridad durante todos los pasos de calentamiento.

  1. ROMPER el Agar LB ReadyPour™ sólido en trozos pequeños apretando vigorosamente y sacudiendo la botella de plástico.
  2. AFLOJAR, pero NO RETIRAR, la tapa de la botella de Agar ReadyPour™. Esto permite que pueda salir el vapor durante el calentamiento. PRECAUCIÓN: Si no se afloja la tapa antes de calentarla, el frasco puede romperse o explotar.
  3. CALENTAR el Agar ReadyPour™ con un microondas durante 60 segundos manteniendo la botella del agar de pie (no tumbar la botella abierta) en el interior del microondas. Retirar con cuidado la botella del microondas y mezclar el agar removiendo la botella. Continuar CALENTANDO la solución en intervalos de 30 segundos hasta que el agar esté completamente disuelto (la solución de color ámbar debe ser transparente y libre de partículas pequeñas).
    NOTA para el Paso 3: Tener mucho cuidado y asegurarse de que el agar no salga de la botella. Debe prestar mucha atención y detener el calentamiento si el agar comienza a burbujear.
  4. ENFRIAR el Agar ReadyPour™ a 60°C removiendo la solución con cuidado para facilitar la disipación del calor.
  5. Mientras el medio se está enfriando, MARCAR las placas de Petri pequeñas (60×15 mm) con un marcador permanente.
    • ABRIR las 2 primeras mangas (con las placas en su interior) y APILAR las 20 placas.
    • A continuación, MARCAR con una raya las 20 placas colocando el marcador en la parte inferior de la pila y arrastrandolo verticalmente hasta la placa superior. Estas placas se utilizarán como placas LB/Amp.
    • ABRIR la segunda manga y ordenar cuidadosamente 10 placas.
    • MARCAR con dos rayas las 10 placas con dos líneas. Estas serán las placas LB/Amp/IPTG. NO MARCAR las 10 placas restantes. Estas serán las placas LB de control. (También debe tener 5 placas de Petri grandes para las placas fuente LB).
  6. VERTER 15 ml del Agar ReadyPour™ atemperado a 60ºC en cada una de las cinco placas de Petri grandes (placas fuente LB) usando una pipeta de 10 ml y una bomba de succión para pipetas (o una pera de succión).
    NOTA: Para verter el Agar LB en las placas:
    • Utilizar una pipeta estéril de 10 ml con una bomba de succión para pipetas (o una pera de succión) para transferir el volumen designado de medio a cada placa de Petri. Pipetear cuidadosamente para evitar la formación de burbujas.
    • Oscilar la placa de petri hacia adelante y hacia atrás para obtener una cobertura completa de la superficie de la placa.
    • Si el medio fundido contiene burbujas, pueden eliminarse pasando una llama a través de la superficie del medio.
    • Tapar la placa de petri y dejar que el medio se solidifique.
  7. Utilizando una pipeta de 10 ml nueva, VERTER 5 ml del agar en las 10 placas petri no marcadas.
    Trans3-5
  8. AÑADIR toda la cantidad de ampicilina a la botella con el agar ReadyPour™ restante. TAPAR y AGITAR la botella para mezclar los reactivos. AÑADIR LOS REACTIVOS SOLAMENTE EN EL AGAR ATEMPERADO. Reactivos como ampicilina e IPTG se degradan a altas temperaturas.
    NOTA IMPORTANTE: Añadir los reactivos solamente cuando el agar este atemperado a 60ºC.
  9. Utilizando una pipeta nueva de 10 ml, VERTER 6 ml del medio LB/Amp en las 20 placas de Petri pequeñas con una raya.
  10. AÑADIR toda la cantidad de líquido IPTG a la botella con el agar ReadyPour™ restante. TAPAR y AGITAR la botella para mezclar los reactivos.
  11. Utilizando una pipeta de 10 ml nueva, VERTER 6 ml del medio LB/Amp/IPTG en las 10 placas de petri pequeñas con dos rayas.
    Trans3-6
  12. TAPAR las placas y ESPERAR al menos veinte minutos para que el agar LB de las placas se solidifiquen. Para obtener resultados óptimos, deje las placas a temperatura ambiente durante la noche.
  13. ALMACENAR a temperatura ambiente durante no más de dos días. Las placas se deben invertir y colocar en una bolsa de plástico que pueda cerrarse heméticamente para asegurarse de que no se sequen.
    NOTA: Si las placas se preparan más de dos días antes del uso, se deben almacenar invertidas en una bolsa de plástico en la nevera (4°C). Sacar las placas de la nevera y calentar en una estufa incubadora a 37°C durante 30 minutos antes de usar.

Preparación de placas de fuente de E. coli
Para mejores resultados, las placas fuente de E. coli deben estar listadas 16-20 horas antes de que se realice la práctica. La preparación de las placas fuente preparadas con más de 24 horas de antelación a la práctica de laboratorio puede comprometer el éxito del proceso de transformación. Si no tiene una estufa incubadora, las colonias se formarán a temperatura ambiente en aproximadamente 24 a 48 horas.

  1. RETIRAR una sola cuenta (o perla) de BactoBead™ del vial usando un asa de inoculación estéril. Utilizando la técnica aséptica, TRANSFERIR la cuenta de BactoBead™ al borde de una placa grande de Petri (placa fuente LB) y volver a colocar la tapa. CERRAR el vial inmediatamente después de usarlo para limitar la exposición a la humedad en el aire.
  2. DISOLVER al instante la cuenta de BactoBead™ añadiendo sobre ella 10 μl de caldo líquido estéril o agua estéril.
  3. DIBUJAR estrías de ida y vuelta con el asa de siembra a través del BactoBead™ disuelto para hacer un estriado primario en la parte superior de la placa. Tratar de no hundir o apretar en exceso el asa de siembra en el medio.
  4. DIBUJAR estrías con el asa de siembra a través del estriado primario a una parte limpia del agar varias veces para crear un estriado secundario.
  5. GIRAR la placa. DIBUJAR estrías con el asa de siembra a través del estriado secundario a una parte limpia del agar varias veces.
  6. GIRAR la placa una vez más. DIBUJAR estrías con el asa de siembra a través del estriado terciario a una parte limpia del agar varias veces. Esto debería producir colonias aisladas.
  7. TAPAR la placa e INCUBAR la placa en posición INVERTIDA a 37°C durante 16 a 20 horas. Si no tiene una estufa incubadora, las colonias se formarán a temperatura ambiente en aproximadamente 24 a 48 horas.Trans3-7
  8. REPETIR los pasos anteriores para cada una de las placas fuente LB.

NOTA: Si el crecimiento en placas es muy elevado (es decir, crecimiento de colonias en césped), los estudiantes deberán transferir células a la solución de CaCl2 con un asa de siembra.

PREPARATIVOS EN EL DÍA DE LA PRÁCTICA

  1. Equilibrar los baños de agua a 37°C y 42°C; y la estufa incubadora a 37°C.
  2. Dispensar 800 µl de CaCl2 en tubos de microcentrífuga para cada uno de los 10 grupos y colocarlos en hielo.
  3. Dispensar 600 µl de Luria Broth Medium («caldo de recuperación») en tubos para cada uno de los 10 grupos y mantenerlos a temperatura ambiente.
    Alternativamente, la botella de caldo de recuperación se puede colocar en una área de pipeteo común en el aula para que los estudiantes lo compartan.
    Preparación del ADN plasmídico de pChromoBlue, pChromoPink y pChromoPurple
    Alícuotas del ADN plasmídico se pueden preparar el día antes de la práctica y almacenarse a 4ºC.
  4. Colocar los tubos del ADN plasmídico de pChromoBlue, pChromoPink, pChromoPurple en hielo para descongelarlos.
  5. Marcar 11 tubos de microcentrífuga como «RTM» para la Mezcla de Transformación Multicolor.
  6. Antes de dispensar, golpear suavemente con los dedos los tubos de pChromoBlue, pChromoPink y pChromoPurple hasta que todas las muestras estén en el fondo cónico de los tubos (opcionalmente se puede dar un golpe de centrifugación a los tubos).
  7. Utilizando una micropipeta automático, dispensar 50 μl de pChromoBlue, 50 μl de pChromoPink y 50 μl de pChromoPurple en UNO de los tubos marcados. Mezclar los plásmidos agitando suavemente el tubo.
  8. Utilizando una pipeta automática, dispensar 12 μl de la mezcla de transformación multicolor en cada uno de los 10 tubos de microcentrífuga marcados.
    NOTA: Los estudiantes usarán 10 μl para el experimento de transformación.
  9. Cerrar los tubos y colocarlos en hielo.

Material que debe recibir cada grupo
Cada grupo de prácticas debe recibir los siguientes componentes antes de iniciar el procedimiento experimental:

  • • Compartir la placas fuente de E. Coli si se utiliza la transformación por placa (apéndice A).
  • 1 tubo CaCl2 (800 µl).
  • 1 tubo de Mezcla de transformación multicolor «RTM» 12 µl.
  • 1 tubo de «caldo de recuperación» (600 µl).
  • 2 placas de una raya LB agar + Amp.
  • 1 placa de dos rayas LB agra + Amp +IPTG.
  • 1 placa sin rayas LB agar.
  • 2 asas de siembra o inoculación estériles.

Equipos de Aula

  • Baño(s) de agua.
  • Estufa de Incubación.

ESQUEMA RESUMEN DE LA PRÁCTICA

Trans3-8

 

PRÁCTICA

Se pueden utilizar 2 protocolos:

  1. Transformación utilizando placa de cultivo (CLásico). APÉNDICE A.
  2. Transformación utilizando medio de cultivo líquido (Enhanced).REQUIERE ELUSO DE CULTIVOS LÍQUIDOS Y CENTRIFUGA Y PRODUCE RESULTADOS MEJORES.

ENHANCED
Preparación células competentes para la transformación.

Trans3-9

  1. OBTENER 2 microtubos de cultivo inicial de E.coli a partir de su profesor y MARCAR con el número del grupo. Mantener los microtubos en hielo el mayor tiempo posible durante este modulo.
  2. CENTRIFUGAR los microtubos a máxima velocidad durante 5 minutos para obtener el pellet celular.
  3. Cuidadosamente ELIMINAR el sobrenadante. NO MOVER EL PELLET CELULAR.
  4. AÑADIR 200 µl de CaCl2 enfriado a cada microtubo. Suavemente, RESUSPENDER las células con micropipeta (sube y baja). Guardar el resto de CaCl2 en hielo para más tarde.
    IMPORTANTE: las células se deben resuspender completamente, pipetear suavemente hasta que no se observen grumos en la solución de CaCl2.
  5. INCUBAR los microtubos en hielo 10 minutos.
  6. CENTRIFUGAR los microtubos a máxima velocidad durante 5 minutos para obtener el pellet celular.
  7. Cuidadosamente ELIMINAR el sobrenadante. NO MOVER EL PELLET CELULAR.
    NOTA: En este punto las células son frágiles, mantener en hielo y pipetear suavemente.
  8. Lentamente añadir 100 µl de Competent Cell Solution (G) a cada micotubo. Suavemente, RESUSPENDER las células con micropipeta.Inmediatamente colocar los microtubos en hielo.

PUNTO OPCIONAL de STOP: Las células competentes pueden ser conservadas hasta 48 horas en un congelador después de haber sido resuspendidas en la Competent Cell Solution.

Transformación de E. coli con Proteínas Cromógenas Azules, Rosadas y Púrpuras

Trans3-10

  1. MARCAR un microtubo +DNA y otro con -DNA.
  2. AÑADIR 150 µl CaCl2 frío en ambos microtubos. MEZCLAR con micropipeta (sube y baja) suavemente.
  3. AÑADIR 10 μl de la mezcla de transformación rainbow «RTM» al tubo marcado «ADN+».
    NO añadir el plásmido al tubo «ADN-«.
  4. MEZCLAR con micropipeta (sube y baja) suavemente.
  5. INCUBAR los tubos en hielo durante 10 minutos.
  6. COLOCAR los tubos de transformación en un baño de agua a 42°C durante 90 segundos.
  7. Volver a colocar inmediatamente los tubos al cubo de hielo e INCUBAR durante dos minutos.
  8. TRANSFERIR 250 μl de Caldo de Recuperación a cada tubo usando una pipeta estéril de 1 ml. Mezclar golpeando suavemente los tubos con los dedos.
  9. INCUBAR las células durante 5 minutos en un baño de agua a 37°C.
  10. Mientras las células se están recuperando, MARCAR el fondo de las cuatro placas de agar como se indica a continuación.
    • ADN- (placa sin rayas).
    • ADN-/Amp+ (placa con una raya).
    • ADN+/Amp+ (placa con una raya).
    • ADN+/Amp+/IPTG+ (placa con dos rayas).
      Trans3-11
  11. Después del período de recuperación, RETIRAR los tubos del baño de agua. CENTRIFUGAR los microtubos a máxima velocidad durante 5 minutos para obtener el pellet celular.
  12. ELIMINAR 300 µl de sobrenadante. NO MOVER EL PELLET CELULAR.
  13. RESUSPENDER suavemente el pellet en el líquido que queda.
  14. Con una nueva punta, TRANSFERIR 100 µl de células transformadas en el centro de la apropiada placa de LB agar.
  15. EXTENDER las células sobre toda la placa utilizando un asa de siembra. Utilice un asa de siembra estéril para extender ambas muestras de ADN-. Utilizar un asa de siembra nueva para extender las muestras de ADN+. Asegurarse que las células se han extendido por toda la superficie de las placas.
  16. CUBRIR las placas y ESPERAR cinco minutos para que la suspensión celular sea absorbida por el agar.
    NOTA: Las células pueden tardar más tiempo en absorberse en el medio. No invertir las placas si las células no han sido completamente absorbidas en el medio.
  17. APILAR las placas una encima de otra y fijarlas juntas. MARCAR las placas con las iniciales de los estudiantes o el número de grupo.
  18. COLOCAR las placas en la posición invertida (con el agar en la parte superior) en una estufa de incubación bacteriana a 37°C para incubarlas durante la noche (24 horas). Si no tiene una incubadora, las colonias se formarán a temperatura ambiente en aproximadamente 24 a 48 horas.
  19. OBSERVAR las placas de transformación y control y REGISTRAR lo siguiente:
    • El número de colonias en la placa.
    • El color de las bacterias. Si los colores son débiles, incubar las placas a 4°C durante 24 horas adicionales.

RESULTADOS DE LA PRÁCTICA Y ANÁLISIS

RECOPILACIÓN DE DATOS

  1. Observar los resultados obtenidos en las placas de transformación y control.
    • Placas de control: ADN (-)
      • ADN-.
      • ADN-/Amp+.
    • Placas de Transformación: ADN (+)
      • ADN+/Amp+.
      • ADN+/Amp+/IPTG2+.
  2. Dibujar y describir lo que se observa. Para cada una de las placas, registrar lo siguiente:
    • ¿Cuánto crecimiento bacteriano observas? Determine un recuento.
    • ¿De qué color son las bacterias?.
    • ¿Por qué diferentes grupos de una clase tienen diferentes eficiencias de transformación?.
    • Si no se obtienen resultados, ¿qué factores podrían atribuirse a este hecho?.

DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE LA TRANSFORMACIÓN
La eficiencia de transformación es una determinación cuantitativa del número de células transformadas por 1 μg de ADN plasmídico. En esencia, es un indicador del éxito del experimento de transformación.
Se calcula la eficiencia de la transformación usando los datos recogidos durante la práctica.

  1. Contar el número de colonias en la placa que está marcada como: DNA+/Amp+/IPTG+.
    Un método sencillo para realizar un seguimiento de las colonias contadas es marcar cada colonia con marcador de laboratorio en el exterior de la placa.
  2. Determine la eficiencia de transformación utilizando la siguiente fórmula:
    (Nº transformantes/μg de ADN)x(vol. final de recuperación (ml)/vol. sembrado (ml))=Nº transformantes por μg.

RESULTADOS

Trans3-16
Trans3-17
Trans3-18
Trans3-19
ADN-
ADN-/Amp+
ADN+/Amp+
ADN+/Amp+/IPTG+
Sembrada con células de control (sin ADN)
Sembrada con células control (sin ADN)
Sembrada con células transformadas (Mezcla de transformación multicolor)
Sembrada con células transformadas (Mezcla de transformación multicolor)
Resultado
No se visualizan células coloreadas. Colonias blancas. Puede parecer como recubierto de una capa de células.
No hay colonias visibles.
Colonias blancas
Colonias individuales rosadas, azules y púrpuras.
Demuestra
Las células bacterianas del huésped son viables en ausencia de ampicilina.
Las células no transformadas son sensibles a la ampicilina.
Las células son resistentes a Ampicilina cuando se transforman con la mezcla de los tres plásmidos (pChromoBlue, pChromoPink y pChromoPurple). Las proteínas coloreadas no se producen en ausencia de IPTG
Las células son resistentes a Ampicilina cuando se transforman con la mezcla de los tres plásmidos (pChromoBlue, pChromoPink y pChromoPurple). La producción de proteína cromogénica se activa en presencia de IPTG.

PREGUNTAS

Responder a las siguientes preguntas en la libreta de prácticas:

  1. ¿En qué placa(s) se esperaría encontrar bacterias más parecidas a la E. coli de la placa fuente? Razonar la respuesta.
    Las bacterias en la placa marcada con ADN- serían idénticas a la placa fuente de E. coli porque no tienen ningún plásmido añadido a ellas, y se siembran en placas con medios no selectivos.
  2. ¿En qué placa(s) se encontrarán sólo células bacterianas genéticamente transformadas? ¿Por qué?
    Las bacterias que crecen en la placa marcada con ADN+/Amp+ o ADN+/Amp+/IPTG+ tendrían las células transformadas genéticamente ya que sólo aquellas células que han tomado el plásmido que expresa el gen de resistencia a la ampicilina sobrevivirán Los medios selectivos.
  3. ¿Cuál es el propósito de las placas de control? Explicar la diferencia entre los controles que se realizan en la práctica y por qué es necesario cada uno de estos controles.
    Las placas de control ayudan a interpretar los resultados experimentales. Hay dos placas de control en este experimento. La placa de control que se etiqueta ADN-/Amp+ muestra que las células huésped de E. coli sólo crecen en medios selectivos en presencia del plásmido. La placa de control marcada con ADN muestra que las células sin el plásmido son capaces de crecer en agar sin ampicilina.
  4. ¿Por qué comparar las placas de ADN-/Amp+ y DNA+/Amp+?
    Las células no tratadas con el plásmido no crecerán en la placa ADN-/Amp+ porque no expresan el gen de resistencia a la ampicilina. Sin embargo, las células tratadas con el plásmido crecerán en la placa ADN+/Amp+ porque expresan el gen de resistencia a la ampicilina.

APÉNDICE A

Protocolo de transformación clásico utilizando placa de cultivo

Trans3-13

Para obtener los mejores resultados, asegurarse que las células se resuspenden completamente.

Trans3-14

  1. MARCAR un tubo de microcentrífuga como «ADN+» y un segundo tubo de microcentrífuga como «ADN-«.
  2. TRANSFERIR 500 μl de solución de CaCl2 helada en el tubo «ADN-» usando una pipeta estéril de 1 ml.
  3. Utilizando una asa de siembra, TRANSFERIR aproximadamente 15 colonias bien aisladas (cada colonia debe tener un tamaño aproximado de 1-1,5 mm) desde la placa fuente de E. coli hasta el tubo «ADN-«.
  4. GIRAR el asa de siembra entre los dedos para liberar las células. RESUSPENDER las células bacterianas en la solución de CaCl2 agitando la suspensión con un agitador vortex hasta que no se vean grupos de células y la suspensión de células aparezca turbia.
  5. TRANSFERIR 250 μl de la suspensión celular al tubo marcado con «ADN+». COLOCAR los tubos en hielo.
  6. AÑADIR 10 μl de la mezcla de transformación rainbow «RTM» al tubo marcado «ADN+».
    NO añadir el plásmido al tubo «ADN-«.
  7. MEZCLAR las muestras golpeando suavemente los tubos con los dedos. INCUBAR los tubos en hielo durante 10 minutos.
  8. COLOCAR los tubos de transformación en un baño de agua a 42°C durante 90 segundos.
  9. Volver a colocar inmediatamente los tubos al cubo de hielo e INCUBAR durante dos minutos.
  10. TRANSFERIR 250 μl de Caldo de Recuperación a cada tubo usando una pipeta estéril de 1 ml. Mezclar golpeando suavemente los tubos con los dedos.
  11. INCUBAR las células durante 30 minutos en un baño de agua a 37°C.
  12. Mientras las células se están recuperando, MARCAR el fondo de las cuatro placas de agar como se indica a continuación.
    • ADN- (placa sin rayas).
    • ADN-/Amp+ (placa con una raya).
    • ADN+/Amp+ (placa con una raya).
    • ADN+/Amp+/IPTG+ (placa con dos rayas)
  13. Después del período de recuperación, RETIRAR los tubos del baño de agua y colocarlos en el banco de laboratorio.
    Trans3-15
  14. Utilizando una pipeta estéril de 1 ml, TRANSFERIR 250 μL de células recolectadas del tubo denominado «ADN-» en el centro de las placas marcadas como ADN- y ADN-/Amp+.
  15. Utilizando una pipeta estéril nueva de 1 ml, TRANSFERIR 250 μL de células recolectadas del tubo marcado «ADN+» en el centro de las placas DNA+/Amp+ y DNA+/Amp+/IPTG+.
  16. EXTENDER las células sobre toda la placa utilizando un asa de siembra. Utilice un asa de siembra estéril para extender ambas muestras de ADN-. Utilizar un asa de siembra nueva para extender las muestras de ADN+. Asegurarse que las células se han extendido por toda la superficie de las placas. CUBRIR las placas y ESPERAR cinco minutos para que la suspensión celular sea absorbida por el agar.
  17. APILAR las placas una encima de otra y fijarlas juntas. MARCAR las placas con las iniciales de los estudiantes o el número de grupo. COLOCAR las placas en la posición invertida (con el agar en la parte superior) en una estufa de incubación bacteriana a 37°C para incubarlas durante la noche (24 horas). Si no tiene una incubadora, las colonias se formarán a temperatura ambiente en aproximadamente 24 a 48 horas.
    NOTA: Las células pueden tardar más tiempo en absorberse en el medio. No invertir las placas si las células no han sido completamente absorbidas en el medio.
  18. OBSERVAR las placas de transformación y control y REGISTRAR lo siguiente:
    • El número de colonias en la placa.
    • El color de las bacterias. Si los colores son débiles, incubar las placas a 4°C durante 24 horas adicionales.

GUÍA DE SOLUCIÓN DE PROBLEMAS EN LA TRANSFORMACIÓN

Crecimiento pobre de células en la placa fuente

Colonias satélites vistas en la placa de transformación

Las colonias aparecen en la placa de transformación como una mancha

No se observan colonias en las placas de transformación

Bajo rendimiento en la transformación

 

Fabricado por Bioted

Valoraciones

No hay valoraciones aún.

Solo los usuarios registrados que hayan comprado este producto pueden hacer una valoración.

Ir al contenido