Tiras de acetato de celulosa para electroforesis, 57×145 mm, 50 tiras

Descripción

PRINCIPIO DEL MÉTODO

La electroforesis permite la separación de proteínas en muestras biológicas como suero, plasma y orina.

PROTEÍNAS SÉRICAS

La separación de las proteínas séricas se realiza con una solución tampón a pH alcalino (pH=8,9). A continuación, las proteínas se fijan y se tiñen con Rojo Ponceau. El tinte no unido se elimina lavando en una solución decolorante ácida. Al final del proceso, se mostrará un patrón típico con cinco bandas en la tira. Las bandas, también llamadas «fracciones», son las proteínas presentes en el suero y se denominan Albúmina, Alfa 1, Alfa 2, Beta y Gamma, según su movilidad. Las variaciones en su concentración y posición, así como la aparición de bandas anormales, tienen un importante valor diagnóstico cualitativo. La densitometría de las bandas teñidas y el procesamiento de los datos mediante un software especializado mostrarán un gráfico que muestra las cinco fracciones, cuya concentración relativa se expresa en valores porcentuales.

Muestra:
Suero fresco. Evite muestras con hemólisis, signos de deterioro o coágulos.
Las muestras se pueden almacenar a 2-8°C durante 48 horas.

HEMOGLOBINAS

Las hemoglobinas son una clase de proteínas que contienen hierro y cuya función principal es transportar oxígeno desde los pulmones hacia los tejidos y órganos del cuerpo. Las hemoglobinas están compuestas por cuatro cadenas de globina. Diferentes composiciones de las globinas caracterizan el tipo de hemoglobinas, por ejemplo, HbA, HbF, HbS, HbA2. La hemoglobina mayoritaria en los eritrocitos de los adultos normales es la HbA y hay pequeñas cantidades de HbA2 y HbF. Además, ahora se conocen más de 400 hemoglobinas mutantes, algunas de las cuales pueden causar efectos clínicos graves, especialmente en estado homocigoto o en combinación con otra hemoglobina anormal.

La electroforesis sobre acetato de celulosa a pH alcalino permite separar las hemoglobinas normales HbA y HbA2, y muchas variantes como HbF (hemoglobina fisiológica también en pequeñas cantidades en adultos normales) y hemoglobinas mutantes, como HbS y HbC. La inspección visual del patrón se realiza para evaluar la presencia de hemoglobinas anormales. El uso de la Solución Control de Hemoglobina proporciona marcadores para la comparación correcta de las posiciones de las bandas de la muestra con las del Control.

Preparación de hemolizado:
Sangre total recogida en tubos que contienen EDTA. Las muestras se pueden almacenar a 2-8°C durante 48 horas.

Procedimiento de preparación de muestra (Hemolizado de glóbulos rojos):

1. Coloque 1 ml de sangre total en un tubo de ensayo de 10 ml y agregue 9 ml de solución salina (NaCl 9 g/l).
2. Incline el tubo de ensayo para suspender los glóbulos rojos en la solución salina y centrifugue a 4000-5000 rpm durante 5 minutos.
3. Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente los glóbulos rojos sedimentados agitando el tubo de ensayo. Agregue 9 ml de solución salina fresca.
4. Repita los pasos 2 y 3 dos veces. Al final de estos pasos, el sobrenadante debe estar claro e incoloro. Esto asegurará que los glóbulos rojos se hayan lavado correctamente.
5. Elimine el sobrenadante y agregue 3 ml de Solución de Lisis R4 o agua destilada. Asegúrese de que el agua destilada esté limpia y no presente partículas en suspensión. Espere durante 5 minutos.
   NOTA: Independientemente de la concentración inicial de Hb en la muestra de sangre total, adapte el volumen de Solución de Lisis R4 o agua destilada para obtener una concentración final de Hb en el hemolisado de 2-3 g/dl.
6. Coloque el tubo de ensayo en un Vortex y agite durante 10 segundos. Este paso ayudará a romper todas las membranas de los glóbulos rojos. La solución resultante se llama «hemolizado».
7. Centrifugue a la velocidad máxima que pueda alcanzar la centrífuga, durante 5 minutos.
8. Tome la cantidad de hemolizado para la prueba. Asegúrese de tomar la muestra NO en el fondo del tubo de ensayo sino en la superficie del líquido rojo. Se pueden utilizar volúmenes más pequeños para la preparación de la muestra. La idea es lavar los glóbulos rojos con solución salina en una proporción de 1 volumen de glóbulos rojos y 9 volúmenes de solución salina, durante 3 veces. El paso de lisis se puede realizar con agua destilada o Solución de Lisis en una proporción de 1 volumen de glóbulos rojos lavados y 3 volúmenes de agua destilada o Solución de Lisis. Después de la centrifugación, el último paso de recoger el hemolizado en el borde del líquido en el tubo de ensayo es importante para la buena calidad de la muestra.

ISOENZIMAS

Las isoenzimas son formas múltiples de la misma enzima que difieren en su secuencia de aminoácidos, pero catalizan la misma reacción química. Cada isoenzima muestra diferentes parámetros cinéticos (por ejemplo, diferentes valores de KM) o diferentes propiedades regulatorias. La separación electroforética de enzimas séricas se sigue de reacciones específicas, realizadas mediante el uso de un sistema de reacción de sustrato-cromógeno, que eventualmente desarrollará color.

El resultado es un patrón que muestra las diferentes isoformas (que aparecen como bandas) cuya posición-presencia/ausencia e intensidad de tinción pueden interpretarse con fines diagnósticos.

La separación de las isoenzimas de la Lactato Deshidrogenasa (LD) permite investigar una variedad de enfermedades que involucran el corazón, el hígado, los músculos, los riñones, los pulmones y la sangre. La determinación de las isoenzimas de la Creatina Fosfoquinasa (CK) se utiliza en el diagnóstico y monitoreo de infartos de miocardio y miopatías como la distrofia muscular progresiva de Duchenne.

Muestra
Suero fresco. Las muestras se pueden almacenar a 2-8°C durante 48 horas.
Evite muestras que presenten hemólisis, signos de deterioro o coágulos.

PROCEDIMIENTO DE SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA

1. Sumerja la tira de acetato de celulosa en la solución tampón durante 10 minutos, al objeto de activarla y que los centros activos queden saturados de la disolución en la cual se va a producir la movilidad de los componentes a separar.
2. Retire la tira del tampón colocándola entre dos hojas de papel de filtro.
3. Coloque la tira en el puente de electroforesis.
4. Realice la siembra de la muestra con el aplicador de muestras, a 1 cm del extremo catódico.
5. Ponga suficiente cantidad de tampón en la cubeta de desarrollo de manera que los extremos de la tira de acetato de celulosa queden sumergidos.

 Condiciones de migración electroforética según los métodos:

• Proteínas Séricas: 20 minutos a 220 V (para técnica micro) o 30 minutos a 220 V (para técnica semimicro).
• Hemoglobinas: 30 minutos a 220 V (para técnica micro) o 45 minutos a 220 V (para técnica semimicro).

La alimentación eléctrica debe aplicarse dentro de 1 minuto después de haber colocado la(s) tira(s) en la cámara.

REVELADO

Teñir las tiras con la disolución colorante, sumergiéndolas en dicha disolución durante al menos 10 minutos.

Es muy importante poner las tiras en contacto con la disolución colorante por su cara penetrable.

DECOLORACIÓN

La decoloración se efectúa por lavado de las tiras 3 ó 4 veces en la disolución decolorante, agitando levemente hasta obtener un fondo blanco.

TRANSPARENTADO

1. Deshidratar las tiras con un baño de metanol durante 2 minutos.
2. Pasar a continuación las tiras a un baño de 2-3 minutos en la disolución transparentadora preparada extemporáneamente.
3. Extenderlas sobre una placa de vidrio y calentarlas con un foco estático (lámpara de infrarrojos o estufa) a aproximadamente 100ºC hasta transparencia completa.
4. Dejarlas enfriar y no separarlas del vidrio hasta por lo menos 15 minutos después.

RESULTADOS

Las fracciones proteicas del suero que se separan por electroforesis en acetato de celulosa son la albúmina y las globulinas α1, α2, β y γ.

La concentración normal de proteínas plasmáticas en suero es de 6,0-8,0 g/dL.
En condiciones normales, los porcentajes de cada fracción que se obtiene, son los siguientes:

1. Albúmina: 53-67 %.
2. α1-globulina: 2,5-5 %.
3. α2-globulina: 7-13 %.
4. β-globulina: 9-14 %.
5. γ-globulina: 10-21 %.

CONTIENE

50 Tiras

Rev. 02/2016