Descripción
INTRODUCCIÓN Y PRINCIPIO DE LA PRUEBA
La dimetilarginina simétrica (SDMA) es un aminoácido de arginina metilado. La SDMA se deriva de la metilación intranuclear de residuos de L-arginina y se liberado al citoplasma después de la proteólisis. La SDMA se excreta por riñones.
Varios estudios han encontrado que 1 de cada 3 gatos y 1 de cada 10 perros tienen probabilidades de desarrollar una enfermedad renal durante su vida. SDMA es un biomarcador temprano de la función renal. Se correlaciona bien con tasa de filtración glomerular (TFG). En promedio, la SDMA aumenta en pacientes con enfermedad renal crónica. (ERC) con una pérdida del 30 al 40% de la función renal. La creatinina, sin embargo, no aumenta hasta que se pierde el 75% de la función renal.
SDMA permitirá veterinarios para diagnosticar la enfermedad renal crónica (ERC) mucho antes que Pruebas de creatinina o cistatina C. La SDMA es específica para la función renal. No se ve afectado por otras enfermedades como como enfermedad hepática, enfermedad cardiovascular, enfermedad inflamatoria y endocrina. enfermedades.
Otra característica interesante de SDMA es que no se ve afectada por masa muscular tampoco, lo que simplifica el diagnóstico y seguimiento de la ERC en pacientes delgados. animales geriátricos, especialmente gatos y animales con otras enfermedades que causan pérdida muscular. El SDMA-ELISA competitivo utiliza el formato de placa de microtitulación. SDMA está vinculada a la fase sólida de la placa de microtitulación. La SDMA en las muestras está acilada y compite con la SDMA unida en fase sólida por un número fijo de anticuerpos anti-conejos. Sitios de unión al antisuero SDMA. Cuando el sistema está en equilibrio, libre El antígeno y los complejos antígeno-antisuero libres se eliminan mediante lavado. El El anticuerpo unido a la SDMA en fase sólida se detecta mediante anti-conejo/ peroxidasa. La reacción del sustrato TMB/peroxidasa se controla a 450 nm. La cantidad de anticuerpo unido a la SDMA en fase sólida es inversamente proporcional a la concentración de SDMA de la muestra.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
A su llegada, guarde el kit entre 2 y 8 °C. Una vez abierto el kit es estable hasta su fecha de caducidad. Para conocer la estabilidad de los reactivos preparados, consulte Preparación de Reactivos.
CONTENIDO DEL KIT
MT-Strips (STRIPS)
12 tiras de 8 pocillos cada uno, separados, recubiertos previamente con SDMA.
Estándares (CAL 1 – 6)
6 viales de 4 ml, listo para usar.
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Standard |
1
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2
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3
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4
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5
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6
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μmol/l
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0
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0,2
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0,4
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0,7
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1,2
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3
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ng/ml
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0
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40
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81
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141
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242
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606
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Control 1 y 2 (CON 1 & 2)
2 viales de 4 ml listo para usar, Rango: ver certificado de control de calidad.
Reactivo de Acilación (ACYL-REAG)
3 viales lyoph., disolver el contenido en 3 ml de disolvente antes de usar
Tampón de Acilación (ACYL-BUFF)
1 vial de 3,5 ml, listo para usar, color azul.
Disolvente (SOLVENT)
2 viales 5 ml listos para usar, contiene DMSO, Tenga en cuenta que el disolvente reacciona con muchos plásticos. materiales que incluyen bandejas de plástico; El disolvente no reacciona. con puntas de pipeta normales y con dispositivos de vidrio.
Antisuero (AS)
1 vial de 7 ml, listo para usar, Rabbit-anti-N-acil-SDMA, color amarillo.
Conjugado Enzimático (CONJ)
1 vial de 13 ml, listo para usar, Peroxidasa IgG anti-conejo de cabra.
Tampón de lavado (WASH)
1 vial de 20 ml, concentrado. (50x), Diluir con dist. Agua hasta 1000 ml de volumen total.
Sustrato (SUB)
1 vial 13 ml de solución TMB, lista para usar.
Solución de parada (STOP)
1 vial de 13 ml, listo para usar, contiene ácido sulfúrico 0,3 M, no corrosivo.
Placa de reacción (ACYL-PLATE)
1 pieza Para acilación.
Reactivo Igualador (EQUA-REAG)
1 vial lyoph., disolver el contenido con 21 ml dist. agua, disolver con cuidado para minimizar la formación de espuma.
Papel de aluminio (FOIL)
2 piezas Listo para usar.
MATERIALES Y EQUIPOS NECESARIOS PERO NO PROPORCIONADOS
- Pipetas (20, 50, 100 y 200 µl).
- Pipeta multicanal.
- Agitador orbital.
- Dispositivo de lavado de microplacas.
- Fotómetro de microplacas (450 nm).
- Mezclador Vortex, mezclador de rodillos.
TOMA DE MUESTRA
La prueba se puede realizar tanto con suero como con plasma con EDTA. No se deben utilizar muestras hemolíticas y lipémicas.
Las muestras se pueden almacenar hasta 6 horas a 2 – 8 °C. Para un almacenamiento más prolongado (hasta a 18 meses) las muestras deben mantenerse congeladas a -20 °C Se debe evitar la congelación y descongelación repetidas.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y MUESTRAS
Tiras de microtitulación
Antes de abrir el paquete de tiras de pocillos STRIPS, déjelo reposar a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos. Después de abrir, mantenga los pocillos no utilizados en el paquete de aluminio original con el desecante provisto. Vuelva a cerrar con cuidado y almacene a 2 – 8°C.
Tampón de lavado
Diluir el contenido de WASH con dist. agua hasta un volumen total de 1.000 ml, mezclar brevemente. El tampón de lavado diluido debe almacenarse entre 2 y 8 ºC y es estable. durante 4 semanas. Para un almacenamiento más prolongado, se debe almacenar el tampón de lavado diluido. congelado a -20°C.
Reactivo de ecualización
Disolver el contenido de EQUA-REAG con 21 ml dist. agua, mezclar brevemente y dejar en un agitador durante 20 minutos. Evite el exceso de formación de espuma. El El reactivo de ecualización reconstituido debe almacenarse congelado a -20 °C y estable hasta la fecha de vencimiento.
Reactivo de acilación
Disolver el contenido de un frasco de ACYL-REAG con 3 ml de Solvente y agitar durante 10 minutos en un agitador orbital. Después de su uso, el reactivo debe ser descartado. El reactivo de acilación siempre debe prepararse inmediatamente. antes de su uso y es estable durante un mínimo de 3 horas. Las otras dos botellas permiten una segunda y tercera ejecución de la prueba. Si se va a utilizar todo el kit en una sola pasada, es Se recomienda combinar el contenido disuelto de los dos viales de Acilación. Tenga en cuenta que el disolvente reacciona con muchos materiales plásticos, incluido el plástico. Bandejas que se utilizan como depósito para pipetas multicanal. El disolvente no reaccionar con puntas de pipeta normales y con dispositivos de vidrio. Se recomienda Utilice una multipeta, llénela directamente desde el vial y agregue el reactivo de acilación a los pocillos.
Todos los demás reactivos están listos para su uso.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS (ACILACIÓN)
Los pocillos de la placa de reacción ACYL-PLATE para la acilación sólo se pueden utilizar una vez. Marque los pocillos respectivos antes de su uso para evitar el uso repetido.
- Pipetee 20 µl de cada uno de los estándar 1 – 6, 20 µl de control 1 y 2, y 20 µl de muestra del paciente en los pocillos respectivos del Placa de reacción ACYL-PLATE (se recomiendan duplicados).
- Pipetee 20 µl de tampón de acilación ACYL-BUFF en cada pocillo.
- Pipetee 200 µl del reactivo igualador reconstituido EQUA-REAG en cada pocillo.
- Mezcle la placa de reacción durante 10 segundos.
- Pipetee 50 µl de reactivo de acilación ACYL-REAG recién preparado en cada pocillo, mezcle inmediatamente. Se recomienda utilizar una pipeta multicanal, llenarla directamente del vial y añadir el reactivo de acilación a los pocillos. El color cambia a violeta.
- Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente (aprox. 20 °C) en un agitador orbital. No cubra los pocillos ni la placa, deje la placa abierta en el agitador.
Tome 20 µl de las muestras aciladas para SDMA-ELISA.
PROCEDIMIENTO DE PRUEBA ELISA
Lleve todos los reactivos a temperatura ambiente y mézclelos con cuidado, evite Desarrollo de espuma.
Incubación de muestras
Transfiera cada 20 µl de Estándares 1 a 6 acilados, 20 µl de controles acilados y 20 µl de muestras aciladas de la placa de reacción en los pocillos respectivos del tiras de microtitulación recubiertas. Pipetee 50 µl de Antisuero AS en cada pocillo. Cubra la placa con papel de aluminio adhesivo e incube las tiras de microtitulación durante 90 minutos a temperatura ambiente (20 – 25 °C) en un agitador orbital.
Lavado
Deseche o aspire el contenido de los pocillos y lávelos minuciosamente, cada uno, con 300 µl de tampón de lavado WASH diluido. Repetir el procedimiento de lavado. 4 veces. Elimine el líquido residual golpeando la placa invertida sobre una superficie limpia. papel absorbente.
Incubación conjugada
Pipetear 100 µl de conjugado enzimático CONJ en cada pocillo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital.
Lavado
Repita el paso de Lavado anterior.
Incubación de sustrato
Pipetee 100 µl de sustrato SUB en cada pocillo e incube durante 25 ± 5 minutos. a temperatura ambiente en un agitador orbital.
Parada
Pipetee 100 µl de solución de parada STOP en cada pocillo y mezcle en un agitador orbital. durante aprox. 30 segundos.
Lectura
En 15 minutos, lea la densidad óptica a 450 nm (longitud de onda de referencia entre 570 y 650 nm) en un fotómetro de microplacas.
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
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Standard |
1
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2
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3
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4
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5
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6
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μmol/l
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0
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0,2
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0,4
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0,7
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1,2
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3
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ng/ml
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0
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40
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81
|
141
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242
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606
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En un papel cuadriculado semilogarítmico, la concentración de los estándares (eje x, logarítmico) se trazan frente a su densidad óptica correspondiente (eje y, lineal). Se utilizan splines cúbicos, 4 parámetros o procedimientos de iteración similares. Recomendado para la evaluación de la curva estándar. La concentración de los controles y muestras se puede leer directamente desde este curva estándar utilizando su densidad óptica promedio.
Los rangos de referencia indicados anteriormente sólo deben tomarse como guía. Es Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
Se agregaron cantidades crecientes de SDMA a una muestra de suero de gato. cada uno de ellos se ensayó la muestra. La recuperación analítica de SDMA se estimó en 10 diferentes concentraciones utilizando las teóricamente esperadas y las realmente valores medidos. La recuperación media de todas las concentraciones fue del 97%. (90 – 104%).
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