Descripción
PRINCIPIO DEL MÉTODO
Los Antígenos Bacterianos son una técnica de aglutinación en porta y tubo para la detección y semicuantificación de anticuerpos anti-Salmonella, Brucella y Proteus en suero humano. Los reactivos, suspensiones bacterianas, coloreadas y estandarizadas, aglutinan en presencia del anticuerpo homologo correspondiente en las muestras ensayadas.
SIGNIFICADO CLÍNICO
El diagnostico de enfermedades febriles puede establecerse bien sea por el aislamiento del microorganismo en sangre, orina o heces o por la demostración del título de anticuerpos específicos, somáticos (O) y flagelares (H) en el suero del paciente. La determinación de estos anticuerpos forma las bases para el ensayo de Widal que establece que altos niveles de anticuerpos O y H superiores a 1/100 en suero, es indicativo de infección por estos microorganismos.
REACTIVOS
| REACTIVO |
Antígeno |
|
Salmonella paratyphi AH |
a flagelar
|
COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS
- Antígenos Bacterianos: Suspensión de Salmonellas, Brucellas y Proteus en tampón glicina, pH 8,2. Conservante.
- Controles: Suero animal. Conservante.
CALIBRACIÓN
No existe referencia internacional para la estandarización de la sensibilidad de estos reactivos, por lo que se utiliza un control interno constituido por suero animal que contiene anticuerpos frente a cada uno de los antígenos citados anteriormente y que ha sido titulado con reactivos comerciales de calidad reconocida.
PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD
Antígenos Bacterianos: Listos para el uso.
Controles: Listos para el uso. Mezclar los reactivos suavemente antes de usar.
Indicadores de deterioro de los reactivos: Presencia de partículas y agregados.Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el envase cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso. No congelar.
MATERIAL ADICIONAL NO SUMINISTRADO
- Agitador rotatorio de velocidad regulable a 80-100 r.p.m.
- Estufa a 37ºC.
- Agitador vortex .
- Pipetas de 50 μL.
MUESTRAS
Suero fresco. Estable 8 días a 2-8ºC o 3 meses a -20ºC.
Las muestras con restos de fibrina deben ser centrifugadas antes de la prueba. No utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas.
PROCEDIMIENTO
Método de aglutinación en porta (cualitativo)
- Dejar atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
- Depositar 50 μL de la muestra a ensayar (Nota 1 y 2) y 1 gota (50 μL) de cada control en círculos separados de un porta.
- Mezclar el reactivo vigorosamenteo con el agitador vortex antes del ensayo. Añadir una gota (50 μL) de antígeno próxima a la muestra a ensayar.
- Mezclar con ayuda de un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo.
- Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 80-100 r.p.m., durante 1 minuto.
Método de aglutinación en porta (titulación)
- Utilizando una micropipeta, dispensar 80, 40, 20, 10 y 5 μL de muestra no diluida en círculos separados de un porta.
- Depositar una gota (50 μL) de antígeno en cada círculo próximo a la muestra a ensayar.
- Mezclar con ayuda de un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo.
- Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 80-100 r.p.m., durante 1 minuto.
Método de aglutinación en tubo (semicuantificación)
- Preparar una serie de tubos tal como sigue
| Diluciones |
1/20 |
1/40 |
1/80 |
1/160 |
1/320 |
1/640 |
… |
| Muestra (μL) |
100 |
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
…
|
| NaCI 9 g/L (mL) |
1,9
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
…
|
| |
1 ml ↪️
|
1 ml ↪️
|
1 ml ↪️
|
1 ml ↪️
|
1 ml ↪️
|
1 ml ➡️
|
1 ml
desechar
|
Preparar 2 tubos más para Control Positivo y Negativo: 0,1 mL Control + 0,9 mL NaCI 9 g/L.
Añadir una gota (50 μL) de antígeno a cada tubo.
Agitar e incubar los tubos a 37ºC durante 24 h (Nota 3).
LECTURA E INTERPRETACIÓN
Método de aglutinación en porta
Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente después de retirar el porta del agitador y comparar los resultados con los sueros control. Los resultados obtenidos en el método de titulación en porta,son aproximadamente equivalentes a los que se obtendrían en el método de aglutinación en tubo con diluciones del suero de 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320 respectivamente. Cualquier resultado positivo, es aconsejable confirmar el título mediante el método de aglutinación en tubo.
Método de aglutinación en tubo
Examinar macroscópicamente el modelo de aglutinación (Nota 5) y comparar los resultados con los obtenidos en los tubos control. El control positivo debe mostrar aglutinación parcial o completa. El Control negativo no debe mostrar ningún tipo de aglutinación. Se considera como resultado positivo cualquier grado de aglutinación parcial o completa, con diversos grados de clarificación del sobrenadante. El título de la muestra se define como la dilución mayor que muestra resultado positivo.
CONTROL DE CALIDAD
Se recomienda utilizar el control positivo y negativo para controlar la funcionalidad de los reactivos, así como modelo de comparación para la interpretación de resultados.Todo resultado distinto al resultado que da el control negativo, se considerará positivo.
VALORES DE REFERENCIA
Son generalmente indicativos de infección reciente: Salmonellas: Títulos ≥ 1/80 (anticuerpos somáticos) y ≥ 1/160 (anticuerpos flagelares). Brucellas: Títulos ≥ 1/80. Proteus: Una elevada proporción de individuos normales da resultados positivos con los antígenos de Proteus, especialmente en el ensayo de aglutinación en porta. Un título inferior a 1/160 en tubo, no debe considerarse significativo. El nivel normal de anticuerpos febriles varia ampliamente según los diferentes países y comunidades. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
Todas las características diagnosticas de los distintos reactivos de Antígenos Bacterianos pueden encontrarse en los correspondientes Informes Técnicos que se encuentran a disposición del usuario que lo solicite.
INTERFERENCIAS
Bilirrubina (20 mg/dL), hemoglobina (10 g/L), lípidos (10 g/L) y factores reumatoides (300 UI/mL), no interfieren.
LIMITACIONES DEL MÉTODO
Las infecciones recientes, la inmunodepresión, el efecto prozona (Brucelosis) y la terapia con antibióticos (somáticos), pueden ocasionar falsas negatividades.
Se han descrito reacciones cruzadas con Brucelaen casos de infección o vacunación con algunas cepas de Vibrio cholerae, Pasteurella, Proteus OX19 y Y. enterocolitica (serotipo 9).
NOTAS
- En los ensayos de anticuerpos anti-Brucela, se recomienda reducir la muestra a 20 μL para evitar el efecto prozona.
- En determinadas áreas geográficas, con elevada prevalencia de enfermedades febriles, se recomienda diluir la muestra 1/4 en ClNa 9 g/L antes de realizar el ensayo en porta.
- Se puede acelerar los tiempos de incubación de la siguiente manera:
Antígenos somáticos (O) y Proteus: 48-50 ºC, 4 h.
Antígenos flagelares (H): 48-50ºC, 2 h.
- Un resultado positivo aislado es menos significativo que una variación de títulos obtenidos en ensayos realizados a distintos intervalos de tiempo. El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados del laboratorio, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente.
- La aglutinación somática se caracteriza por ser fina y granular, de formación lenta y difícilmente disgregable. La aglutinación flagelar es algodonosa, de formación rápida y fácilmente disgregable.
CONTIENE
1×50 ml
SGIS06 I-E 25/01/21
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