Danagene Spin Viral RNA, Kit para 100 extracciones

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(*) Estas soluciones deben ser preparadas como se indica en la secciones de Preparaciones Preliminares del protocolo.

EQUIPOS Y REACTIVOS NECESARIOS Y NO PROVISTOS

• Etanol 100 %.
• Microcentrifuga.
• Microtubos de 1,5 ml.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Todos los componentes son estables durante 12 meses desde la fecha de la compra siendo almacenados como se indica.

PREPARACIONES PRELIMINARES

El Tampón de Lisis y el Tampón de Lavado 1 contienen guanidinio de tiocianato que es un agente irritante, por esta razón, recomendamos el uso de gafas y guantes para su manipulación.

Añadir 80 ml Etanol 100 % Tampón Lavado Virus 2*. Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol.

TIPOS DE MUESTRAS

Plasma/suero: Evitar trabajar con muestras que se observe hemólisis. Después de la obtención del plasma o suero, es importante centrifugar la muestra para obtener un material inicial libre de células.

Para muestras sólidas como tejidos (5-10 mg) se puede homogenizar en 300-400 µl de PBS utilizando un homogenizador eléctrico de mano o sistemas de homogenización basados en bolas. Centrifugar la muestra y utilizar 200 µl del sobrenadante transparente libre de partículas.

Para heces preparar una suspensión con PBS, 10% (w/v) y utilizar el mejor sistema para poder lisar todas las partículas víricas. Centrifugar la muestra y utilizar 200 µl del sobrenadante transparente libre de partículas.

Swabs: Incubar el swab en una cantidad adecuada de tampón (ejem. PBS) o medio libre de células durante 30 minutos con movimiento. Eliminar el swab y proceder con 200 µl del sobrenadante transparente libre de partículas.

Medio de transporte / Medio de transporte viral: Vortex los tubos que contienen el hisopo a la velocidad máxima durante 1 minuto. Use 200 µl como muestra de entrada.

En tejidos y heces se debe considerar que se puede copurificar otros ARN que pueden inhibir los siguientes ensayos de PCR.

PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIÓN DE ARN VIRAL A PARTIR DE FLUIDOS BIOLÓGICOS LIBRE DE CÉLULAS

1. Añadir 200 µl de muestra a un microtubo. Si usted procesa muestras de < 200 µl ajustar el volumen final a 200 µl utilizando PBS.
2. Añadir 400 µl Tampón Lisis Viral . Cerrar el microtubo y vortex vigorosamente durante 20 segundos.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. El tiempo de incubación y la temperatura es crítico para la lisis así como para la estabilidad del ARN. Suele ser suficiente una incubación a temperatura ambiente sin perdida significativa de sensibilidad. Se recomienda optimizar estos puntos para el tipo de muestra que se va a utilizar. Se pueden comparar protocolos con y sin el uso de proteinasa K, así como diferentes tiempos y temperaturas de incubación Si la muestra es muy viscosa (esputos) se recomienda el uso de proteinasa K o una incubación a 70ºC.
4. Añadir 30 µl de Tampón Precipitación Proteínas. Vortex 5 segundos. Incubar 1 minuto a temperatura ambiente.
   OMITIR este paso e ir al punto 5 sin añadir el Tampón Precipitación Proteínas si se procesan muestras a partir de Medios de transporte viral como nuestro DANASALIVA/SWAB VIRAL Sample Collection Kit, eNAT (COPAN), DNA/RNA Shield (ZTMO), etc.
5. Centrifugar durante 2 minutos a 11.000 xg.
6. Traspasar el sobrenadante evitando tocar el pellet que se puede formar a un nuevo microtubo.
7. Añadir 350 µl Etanol 100%. Mezclar bien.
8. Pasar la mitad del lisado a una Spin columna RNA con su tubo de recolección. Centrifugar a 8.000 rpm durante 30 segundos.
9. Pasar la otra mitad y centrifugar a 8.000 rpm durante 30 segundos.
10. Añadir 100 µl Tampón de Lavado 1. Centrifugar a 11.000 xg durante 1 minuto.
11. Añadir 700 µl Tampón de Lavado 2. Centrifugar a 11.000 xg durante 1 minuto.
12. Centrifugar 3 minutos a máxima velocidad para eliminar todo el etanol.
13. Elución con 50 µl Agua libre de nucleasas. 2 minutos de incubación. Es muy importante añadir el agua libre de nucleasas en el centro de la membrana para que se humedezca completamente.
14. Centrifugar a 10.000 rpm velocidad durante 60 segundos. Recoger los 50 µl y volver a depositar en el centro de la membrana. Esto hace aumentar el rendimiento.
15. Incubar 2 minutos y centrifugar a máxima velocidad. Si se observan problemas en las detecciones posteriores se puede cambiar el volumen del eluido añadido a RT-PCR.