Danagene spin genomic DNA, kit para 50 extracciones

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* Ver en el apartado de preparaciones preeliminares como preparar estas soluciones

EQUIPOS Y REACTIVOS NECESARIOS Y NO PROVISTOS

• Isopropanol.
• Etanol 100 %.
• Microcentrifuga.
• Microtubos de 1,5 ml.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Todos los componentes son estables durante 12 meses desde la fecha de la compra siendo almacenados como se indica.

ATENCION: El Tampón de Lisis/Unión y el Tampón de Desinhibición contiene guanidine hydrochloride que es irritante, utilizar guantes y gafas.

PROTOCOLO

El protocolo implica los pasos siguientes:

• Las muestras son lisadas con el Tampón de Lisis adecuado y proteinasa K.
• Los ácidos nucleicos se unen a la matriz de fibra de vidrio empaquetada en las MicroSpin Columnas.
• Los ácidos nucleicos son lavados primero con el Tampón de Desinhibición para eliminar los inhibidores de la PCR.
• Lavado de los ácidos nucleicos para eliminar sales, proteínas y otras impurezas.
• Los ácidos nucleicos son eluidos.

PREPARACIONES PRELIMINARES

• Disolver la proteinasa K en 1,1 ml de agua libre de nucleasas y conservar a -20ºC. Se recomienda realizar varias alícuotas para evitar demasiados ciclos de descongelado-congelado. A esta temperatura es estable durante 1 año.
• Verificar que el Tampón de Lisis de Tejidos, Tampón de Lisis/Unión no tienen precipitados debido a las bajas temperaturas. Si es necesario, disolver calentando a 37ºC.
• Añadir el Etanol 100 % al Tampón de Desinhibición indicado en la etiqueta, unos 10 ml. Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol.
• Añadir el Etanol 100 % al Tampón de Lavado indicado en la etiqueta, unos 40 ml. Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol.
• Pre-calentar el Tampón de Elución a 70 ºC puede aumentar el rendimiento de ADN obtenido. Para alguna aplicación posterior puede ser necesario que el ADN esté concentrado, la elución en volúmenes más pequeños de 200 µl incrementará la concentración final de ADN en el eluido pero reducirá el rendimiento global de ADN obtenido. Para muestras que contenga <3 µg ADN, se recomienda una elución en 100 µl. Para muestras que contenga <1 µg ADN, se recomienda una elución en 50 µl.

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE SANGRE TOTAL, «BUFFY COAT» Y CÉLULAS EN CULTIVO

• 200 µl sangre total.
• 200 µl «buffy coat».
• 10⁴– 10⁶ células en cultivo.

Si el material no llega a 200 µl llevar el volumen final de la muestra a 200 µl con agua libre de nucleasas.

1. A 200 µl del material indicado añadir 200 µl del Tampón de Lisis/Unión + 20 µl Proteinasa K. Mezclar bien. Incubar a 70 ºC durante 10 minutos.
2. Añadir 100 μl de Isopropanol. Mezclar bien.
3. Pipetear el lisado en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recogida.
4. Colocar la MicroSpin columna en un nuevo tubo de recogida y añadir al reservorio 500 μl de Tampón de Desinhibición. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
5. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
6. 2º Lavado. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 14.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
7. Centrifugar a máxima velocidad durante 90 segundos para eliminar el etanol residual.
8. Eliminar el tubo de recogida y insertar la spin microcolumna en un microtubo de 1,5 ml. Añadir 50-200 μl de Tampón de elución (precalentado a 70 ºC) en el reservorio de la spin microcolumna. Incubar 2 minutos.
9. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN genómico.

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE 25 mg DE TEJIDOS ANIMALES

1. Cortar 25 mg de tejido humano o animal en pequeños trozos y colocar en un microtubo de 1,5 ml. Añadir 180 μl del Tampón de Lisis de Tejidos + 20 μl Proteinasa K. Mezclar bien. Incubar a 55 ºC durante 1 hora o hasta que la lisis sea completa, las muestras pueden ser incubadas «overnight».
   Las muestras que son difíciles de lisar pueden ser molidas con Ni líquido o pueden ser tratadas directamente con un homogeneizador tipo Polytron.
2. Añadir 200 μl de Tampón de Lisis/Unión. Agitar con Vortex. Incubar a 70 ºC durante 10 minutos. Si se encuentran partículas insolubles, centrifugar 5 minutos a máxima velocidad y traspasar el sobrenadante a un nuevo microtubo.
3. Añadir 100 μl de Isopropanol. Mezclar bien.
4. Pipetear el lisado en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recogida.
5. Colocar la MicroSpin columna en un nuevo tubo de recogida y añadir al reservorio 500 μl de Tampón de Desinhibición. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
6. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
7. 2º Lavado. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 14.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
8. Centrifugar a máxima velocidad durante 90 segundos para eliminar el etanol residual.
9. Eliminar el tubo de recogida y insertar la spin microcolumna en un microtubo de 1,5 ml. Añadir 50-200 μl de Tampón de elución (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la spin microcolumna. Incubar 2 minutos.
10. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN genómico.

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE 25-50 mg DE COLA DE RATÓN

1. Cortar 0,2-0,5 cm de cola de ratón en varios trozos y colocar en un microtubo de 1,5 ml. Añadir 180 μl del Tampón de Lisis de Tejidos + 20 μl Proteinasa K. Mezclar bien. Incubar a 55ºC hasta que la lisis sea completa, las muestras pueden ser incubadas “overnight”. Para eliminar residuos de huesos o pelos, centrifugar durante 5 minutos a velocidad máxima y traspasar el sobrenadante a un nuevo microtubo.
2. Añadir 200 μl de Tampón de Lisis/Unión y 100 μl de Isopropanol. Mezclar bien con un agitador vortex.
3. Pipetear el lisado en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recogida.
4. Colocar la MicroSpin columna en un nuevo tubo de recogida y añadir al reservorio 500 μl de Tampón de Desinhibición. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
5. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
6. 2º Lavado. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 14.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
7. Centrifugar a máxima velocidad durante 90 segundos para eliminar el etanol residual.
8. Eliminar el tubo de recogida y insertar la spin microcolumna en un microtubo de 1,5 ml. Añadir 50-200 μl de Tampón de elución (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la spin microcolumna. Incubar 2 minutos.
9. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN genómico.

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE 10⁹ BACTERIAS

1. Centrifugar 1-1,5 ml de cultivo bacteriano. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 180 μl de Tampón de Lisis de Tejidos y luego añadir 20 μl Proteinasa K. Agitar con Vortex e incubar a 55ºC hasta que se complete la lisis.
   Para aquellas cepas difíciles de lisar, especialmente las Gram+, es necesaria una incubación previa con enzimas líticos. Resuspender el pellet con 200 μl de PBS con 20 mg/ml de lisozima y/o lisostafina (10 mg/ml), incubar 30 minutos a 37ºC, luego añadir 20 μl Proteinasa K e incubar a 55ºC hasta que se complete la lisis.
2. Añadir 200 μl de Tampón de Lisis/Unión. Agitar con Vortex. Incubar a 70ºC durante 10 minutos.
3. Añadir 100 μl de Isopropanol. Mezclar bien.
4. Pipetear el lisado en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recogida.
5. Colocar la MicroSpin columna en un nuevo tubo de recogida y añadir al reservorio 500 μl de Tampón de Desinhibición. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
6. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
7. 2º Lavado. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 14.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
8. Centrifugar a máxima velocidad durante 90 segundos para eliminar el etanol residual.
9. Eliminar el tubo de recogida y insertar la spin microcolumna en un microtubo de 1,5 ml. Añadir 50-200 μl de Tampón de elución (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la spin microcolumna. Incubar 2 minutos.
10. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN genómico.

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE 10⁸ LEVADURAS

1. Centrifugar 3 ml de cultivo de levadura. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 290 μl de EDTA 50 mM y 10 μl de Liticasa (20 mg/ml). Incubar a 37ºC durante 30-60 minutos. Centrifugar a máxima velocidad y eliminar el sobrenadante. Resuspender el pellet con 180 μl de Tampón de Lisis de Tejidos y luego añadir 20 μl Proteinasa K. Agitar con Vortex. Incubar a 55ºC hasta que la lisis se complete.
2. Añadir 200 μl de Tampón de Lisis/Unión. Agitar con Vortex. Incubar a 70ºC durante 10 minutos.
3. Añadir 100 μl de Isopropanol. Mezclar bien.
4. Pipetear el lisado en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recogida.
5. Colocar la MicroSpin columna en un nuevo tubo de recogida y añadir al reservorio 500 μl de Tampón de Desinhibición. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
6. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
7. 2º Lavado. Añadir 500 μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 14.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
8. Centrifugar a máxima velocidad durante 90 segundos para eliminar el etanol residual.
9. Eliminar el tubo de recogida y insertar la spin microcolumna en un microtubo de 1,5 ml. Añadir 50-200 μl de Tampón de elución (precalentado a 70ºC)en el reservorio de la spin microcolumna. Incubar 2 minutos.
10. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN genómico.