Danagene Blood DNA, Kit para 100 ml de sangre

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EQUIPOS Y REACTIVOS NECESARIOS Y NO PROVISTOS

• Isopropanol.
• Etanol 70 %.
• Microtubos de 1,5 ml.
• Tubos de centrifuga de 15 o 50 ml.
• Microcentrifuga o centrifuga clínica.
• Vortex.
• Baño de agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Todos los componentes son estables durante 12 meses desde la fecha de compra siendo almacenados y utilizados como se indica.

PROTOCOLO

El protocolo implica los siguientes pasos:

• Lisis selectiva de los eritrocitos, las células que contienen el ADN son separadas de los eritrocitos que son lisados.
• Lisis celular. Las células son lisadas con un detergente aniónico que solubiliza los componentes celulares.
• Precipitación de proteínas. Se eliminan las proteínas citoplasmáticas y nucleares por precipitación salina.
• Precipitación ADN. El ADN genómico se extrae con una precipitación con isopropanol.
• Hidratación del ADN. El pellet de ADN es disuelto en agua estéril o la solución de hidratación mediante incubación a 65 ºC o «overnight» a Tª ambiente y agitación.

PREPARACIONES PRELIMINARES

Si la Solución de Lisis contiene un precipitado debido a las bajas temperaturas, incubar a 37ºC y mezclar para disolver el precipitado.

PROTOCOLO EXTRACCIÓN A PARTIR DE SANGRE TOTAL

1. Recoger la sangre en tubos que contengan 15 % EDTA para reducir la degradación del ADN y coagulación, otros anticoagulantes como el citrato de sodio o heparina también funcionan bien.
2. Las muestras frescas pueden conservarse a 4 ºC por no más de 5 días.
3. Las muestras congeladas son estables a -80 ºC por dos años.

EXTRACCIÓN A PARTIR DE MUESTRAS DE 300 µl. MICROTUBOS 1,5 – 2,0 ml Y MICROCENTRIFUGA

Lisis Celular

• 1. Añadir 300 µl de sangre en un microtubo que contenga 900 µl de Solución Lisis de RBC. Mezclar y incubar durante 10 minutos a Tª ambiente. Invertir el tubo varias veces durante la incubación.
• Centrifugar durante 20-30 segundos a 13.000-16.000 xg. Eliminar el sobrenadante con pipeta sin dañar el pellet visible de células y dejar 10-20 µl de líquido residual.
• Utilizar el vortex con el microtubo para resuspender el pellet, lo cual ayudará a la lisis celular del siguiente paso.
• Añadir 300 µl de Solución de Lisis y resuspender mediante pipeta para lisar las células. Es muy importante observar la solución homogénea sin grupos celulares, se recomienda la incubación a 37 ºC durante 5 minutos o hasta que se observe la solución homogénea.

Precipitación proteica

OPCIONAL: Añadir 1,5 µl RNasa (10 mg/ml) y mezclar bien. Incubar durante 15 minutos a 37 ºC.

• Enfriar la muestra a Tª ambiente.
• Añadir 100 µl de Solución de Precipitación proteica al lisado celular. Vortex vigorosamente a máxima velocidad durante 20-30 segundos.
• Centrifugar a 13.000-16.000 xg durante 3-5 minutos. Se formará un precipitado marrón oscuro. Si se observan partículas flotando volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo.

Precipitación del ADN

• Traspasar el sobrenadante que contiene el ADN a un microtubo nuevo que contiene 300 µl de Isopropanol.
• Mezclar por inversión unas 50 veces.
• Centrifugar a 13.000-16.000 xg durante 2 minutos. El ADN será visible como un pellet blanco.
• Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 300 µl de Etanol 70 % para lavar el ADN.
• Centrifugar a 13.000-16.000 xg durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante sin tocar el pellet de ADN. Se puede volver a centrifugar brevemente para recoger con una micropipeta las últimas gotas de etanol residual evitando tocar el pellet de ADN.
• Invertir el microtubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 15 minutos.

Hidratación del ADN

• Añadir 100 µl de la Solución de Hidratación y resuspender con pipeta.
• Conservar a 2-8 ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o -80 ºC.

EXTRACCIÓN A PARTIR DE MUESTRAS DE 3 ml. TUBOS 15 O 50 ml Y CENTRIFUGAS CLÍNICAS

Lisis Celular

• Añadir 3 ml de sangre en un tubo que contenga 9 ml de Solución Lisis de RBC. Mezclar y incubar durante 10 minutos a Tª ambiente. Invertir el tubo varias veces durante la incubación.
• Centrifugar durante 10 minutos a 2.000 xg . Eliminar el sobrenadante con pipeta sin dañar el pellet visible de células y dejar 100-200 µl de líquido residual.
• Vortex el tubo para resuspender el pellet, lo cual ayudará a la lisis celular del siguiente paso.
• Añadir 3 ml de Solución de Lisis y resuspender mediante pipeta para lisar las células. Es muy importante observar la solución homogénea sin grupos celulares para aumentar el rendimiento en la obtención de ADN, se recomienda la incubación a 37 ºC durante 5 minutos o hasta que se observe la solución homogénea.

Precipitación proteica

OPCIONAL: Añadir 15 µl RNasa (10 mg/ml) y mezclar bien. Incubar durante 15 minutos a 37 ºC.

• Enfriar la muestra a Tª ambiente.
• Añadir 1,0 ml de Solución de Precipitación proteica al lisado celular. Vortex vigorosamente a máxima velocidad durante 20-30 segundos.
• Centrifugar a 2.000 xg durante 5 minutos. Se formará un precipitado marrón oscuro. Si se observan partículas flotando volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo.

Precipitación del ADN

• Traspasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo nuevo que contiene 3 ml de Isopropanol.
• Mezclar por inversión unas 50 veces.
• Centrifugar a 2.000 xg durante 3 minutos. El ADN será visible como un pellet blanco.
• Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 3 ml de Etanol 70 % para lavar el ADN.
• Centrifugar a 2.000 xg durante 2 minutos. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante sin tocar el pellet de ADN. Se puede volver a centrifugar brevemente para recoger con una micropipeta las últimas gotas de etanol residual evitando tocar el pellet de ADN.
• Invertir el microtubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 15 minutos.

Hidratación del ADN

• Añadir 250-500 µl de Solución de Hidratación y resuspender con pipeta.
• Incubar a 65 ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del ADN, o incubar «overnight» a temperatura ambiente con ligera agitación.
• Transferir a un microtubo de 1,5 ml y conservar a 2-8 ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o -80 ºC.

TABLA DE VOLÚMENES DE REACTIVOS ESCALADOS A PARTIR DE 5 µl HASTA 10 ml